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《浙江理工大学》 2010年
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家蚕钙磷蛋白(BmCAPS)的原核表达及定位分析

葛红秀  
【摘要】: 家蚕钙磷蛋白(Bombyx mori calcyphosphine, BmCAPS)是一种钙离子结合蛋白,含有两个EF-hand保守结构域,生物信息学分析预测该蛋白还含有两种类型蛋白激酶的磷酸化位点,推测其可能参与cAMP及钙-磷脂酰肌醇级联介导的交叉信号传递途径,但BmCAPS蛋白的确切功能和作用机理仍不清楚。目前,有关CAPS的研究多数集中在脊椎动物上,在家蚕中还未见报道。 从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到calcyphosphine基因,并将这个基因命名为BmCAPS。此序列包含一个720 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码一个由239个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为26.874 kD,等电点为4.68。将PCR扩增得到的BmCAPS基因的ORF序列插入到原核表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a(+)-BmCAPS,经PCR鉴定、BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定以及测序分析证明重组子构建正确。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)细胞,IPTG诱导表达带His标签的BmCAPS融合蛋白,该融合蛋白的分子量为30.434 kD(融合标签3.56 kD,BmCAPS 26.874 kD)。亲和层析纯化得到较纯的目的融合蛋白,再经FPLC进一步纯化后,进行质谱分析,证实了该蛋白表达的正确性。用纯化的融合蛋白作为抗原免疫雄性新西兰兔,制备多克隆抗血清,间接ELISA法测得抗体效价达1:6400以上,Western blotting检测抗体的特异性良好。用免疫荧光技术检测BmCAPS蛋白在BmN细胞中的定位,结果发现该蛋白只在细胞质中有分布。另外我们应用荧光定量PCR技术和Western blotting技术分别在mRNA转录水平和蛋白表达水平对家蚕的各发育时期和五龄幼虫的各组织进行分析,结果表明,在发育时期中靶mRNA的转录水平由卵到蛾依次升高,这与Western blotting的结果相一致;而在各组织中,精巢中的靶mRNA的转录水平由和蛋白表达水平最高,但在头部、表皮和丝腺中则没有检测到有目的蛋白的表达。上述研究将为进一步探讨BmCAPS蛋白的功能提供一定的依据。
【学位授予单位】:浙江理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q78

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