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《浙江理工大学》 2010年
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人脐带间充质干细胞的分离、鉴定以及干细胞特异性转录因子诱导其重编程的研究

张茜真  
【摘要】: 背景诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的出现不仅为人体组织工程绕开了胚胎干细胞的伦理障碍,而且为干细胞的研究提供了一种新思路新材料。然而,目前iPSC技术尚不成熟,高额的费用和极低的诱导成功率严重制约了iPSC的发展,因此寻求一种既经济又高效的诱导方法是目前亟待解决的科学难题。 间充质干细胞(mesnchymal stem cells,MSCs)是体细胞分化较低的几类细胞之一,因其横向分化能力使其在成体干细胞的研究领域中备受瞩目。相比其他成体细胞,MSCs具有更强的可塑性,因此本课题使用已有的逆转录病毒可能更容易将其诱导成为多能干细胞。 腺病毒载体(adenovirus vector)是一种具有高效转染能力的基因载体,因其容量大、产量高、毒副作用小等优点被广泛应用于基因治疗。本课题初步探索利用腺病毒载体携带Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四个转录因子,能否诱导脐带间充质干细胞进行重编程,探索一条高效、经济的iPSC诱导方法,为临床应用和细胞治疗奠定基础。 实验内容1)由人脐带中分离出间充质干细胞(UCMSCs),于体外培养并鉴定。2)利用已有逆转录病毒载体对其进行iPSC的诱导,并鉴定其相关指标。3)构建嵌合型腺病毒载体Ad5/F11b,且携带Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四个转录因子基因。4)利用构建好的携带转录因子基因的嵌合型腺病毒Ad5/F11b感染UCMSCs,并尝试诱导出多能干细胞。 实验结果1)从人脐带中分离出间质样细胞,经细胞周期、表面标记、分化潜能等指标确定其为间充质干细胞。2)已有的逆转录病毒可成功将所分离的脐带间充质干细胞诱导为人胚胎干细胞(hESCs)样克隆团细胞,检测发现在mRNA水平上4个转录因子均不同程度的上调表达,且与hESCs相关基因的表达水平也明显提高。可进一步检测其生化指标确定是否为iPSC。3)构建携带Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四个转录因子基因的嵌合型腺病骨架质粒,经酶切鉴定确定为正确克隆,并于HEK293细胞中包装出病毒。4)利用携带4个转录因子的嵌合型腺病毒感染UCMSCs,出现类似hESCs的克隆团细胞,还需进一步证实iPSC的诱导情况。 结论1)成功于人脐带中分离出间充质干细胞,并通过逆转录病毒诱导成hESCs样克隆团细胞,该细胞与hESCs相关的4个转录因子均不同程度的上调表达,表现出类似hESCs特征。 2)成功构建携带Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四个转录因子基因的嵌合型腺病骨架质粒,并于HEK293细胞中包装出病毒。3)利用携带4个转录因子的嵌合型腺病毒感染UCMSCs后,出现类似hESCs的克隆团细胞,还需进一步证实iPSC的诱导情况。
【学位授予单位】:浙江理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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【引证文献】
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【参考文献】
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