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《浙江理工大学》 2010年
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家蚕TRAPα基因的表达与功能分析

朱立明  
【摘要】: 哺乳动物TRAPα是一个糖基化蛋白,大小为34 kD,它受到Ca~(2+)的调控,分布在内质网膜和核膜。在人类骨髓细胞系中,TRAPα的mRNA转录受到巨噬性粒细胞集落刺激因子的正调控作用。研究发现,在出生后的小鼠骨骼肌和心脏细胞中TRAPα表达有些略微不同,在体内系统中首次确定TRAPα蛋白可能在肌肉中和在小鼠心脏内皮衬底细胞的成熟过程中起了特定作用。 从家蚕蛹的cDNA文库中筛选得到一条含有TRAPα保守结构域的cDNA,并将其命名为BmTRAPα(Bombyx translocon associated protein alpha),GenBank登陆号为DQ311413。该基因序列长为1389 bp,ORF是840 bp,编码279个氨基酸残基,预测分子量为30.8 kD。将扩增得到的BmTRAPα基因产物酶切回收后,克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到重组质粒pET-28a-BmTRAPα,经PCR和酶切鉴定证明重组子正确,将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),终浓度为1 mM的IPTG诱导表达,收集菌体并制样,SDS-PAGE分析表明,在Marker大小35 kD附近有一浓集特异性蛋白条带,与预期值相符(融合标签3.56 kD,BmTRAPα是30.8 kD)。融合蛋白以包涵体形式存在,通过处理包涵体和镍柱亲和层析,纯化获得融合蛋白,并用该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1:12800。用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体。 提取家蚕各时期及五龄幼虫的各组织蛋白,用于Western blot和ELISA半定量测定BmTRAPα在各时期和五龄幼虫各组织的含量。Western blot结果表明,BmTRAPα蛋白在家蚕的蛹期表达量最高;五龄幼虫的生殖腺、丝腺、马氏管和脂肪体有表达,表达量有所不同,丝腺和脂肪体中表达量较高,而在血淋巴中没有检测明显的信号。ELISA半定量检测结果与Western blot的实验结果基本相符。利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹和蛾等发育时期,以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较,翻译水平与转录水平存在一定差异。 以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,在整个细胞周期,BmTRAPα蛋白均主要分布在细胞质中。
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