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《浙江理工大学》 2010年
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黄瓜花叶病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究

李喜英  
【摘要】: 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是目前对农业经济危害最为严重的植物病毒之一。CMV 2b蛋白在CMV的致病过程中扮演着致病因子,RNA沉默抑制子和病毒长距离移动决定因子等多个重要的角色。因此,阐明CMV 2b蛋白的致病机理对于发展控制CMV新方法和新策略具有重要的理论指导意义。 FRad35~(2b)-CMV重组病毒是用Rad35-CMV株系的2b基因精确替换Fny-CMV株系的2b基因构建而成,该重组病毒在多种烟草寄主上均诱导轻花叶症状。其突变株FRad35~(2bLeu)-CMV病毒,和FRad35~(2b)-CMV仅有一个氨基酸之差,即第55位的Leu是由FRad35~(2b)-CMV的Pro突变而来。FRad35~(2bLeu) -CMV在本生烟上则引起严重卷曲叶、植株矮化、甚至植株坏死。Northern杂交分析FRad35~(2b)-CMV和FRad35~(2bLeu)-CMV在本生烟寄主中的子代RNA积累量,接种后第14天,结果显示: FRad35~(2bLeu)-CMV的子代RNA积累量显著高于FRad35~(2b)-CMV。由此可见,FRad35~(2bLeu)-CMV的强致病性与其子代RNA在寄主体内的高积累量有关。通过荧光定量PCR检测基因沉默通路中的相关蛋白因子—AGO蛋白家族和RDR蛋白,结果显示:具有高致病性的FRad35~(2bLeu)-CMV显著抑制寄主本生烟AGO家族中AGO1-1、AGO4-1的表达,而弱致病性的FRad35~(2b)-CMV侵染的本生烟中,这些沉默因子的表达量和Mock对照相比都有所升高。基于实验室前期的研究,利用构建好的含有FRad35~(2b)-CMV和FRad35~(2b) Leu-CMV的2b基因的农杆菌瞬时表达载体35S-2b~(Pro)和35S-2b~(Leu)分析2b蛋白的瞬时表达对外源GFP转录后基因沉默的影响。通过电转化获得含有不同载体的农杆菌,并将表达不同2b蛋白的农杆菌与35S-GFP的农杆菌共浸润,在转GFP本生烟16c叶组织中分别瞬时表达GFP和不同的2b蛋白。共浸润第3天,35S-2b~(Leu)和35S-Fny2b的浸润区出现亮绿斑,而35S-2b~(Pro)的浸润区变暗,GFP mRNA的Northern杂交分析确定GFP mRNA在35S-2b~(Leu)和35S-Fny2b的浸润区大量积累;共浸润后第7天,尽管35S-Fny2b和35S-2b~(Leu)仍表现亮荧光信号,但是,二者浸润区的GFPmRNA积累水平显著低于Mock对照,且与35S-2b~(Pro)相当,这些结果说明2b~(Leu)虽然在初期对GFP的局部沉默具有明显的抑制作用,但随着时间的推移,2b~(Leu)并不能抑制浸润区siRNA的产生,从而导致局部GFP mRNA的降解。在共浸润第14天,浸润35S-2b~(Pro)植株的顶端系统叶表现GFP系统沉默,而浸润35S-2b~(Leu)的植株则依旧显绿光,说明其顶端的系统叶GFP没有被诱导沉默。Northern杂交结果也显示:在浸润35S-2b~(Pro)的植株顶端系统叶中检测到少量的GFP mRNA积累,显著低于在35S-2b~(Leu)或35S-Fny2b浸润的植株顶端系统叶中的积累。通过荧光定量PCR检测第3天浸润区基因沉默通路中的AGO4-1和RDR6,结果显示:与Mock相比,出现亮绿斑的35S-2b~(Leu)的浸润区中AGO4-1和RDR6的积累受到抑制,而GFP发生降解的35S-2b~(Pro)的浸润区中AGO4-1和RDR6的表达量反而有一定程度的升高。因此,我们推测第55位的Leu对2b蛋白的高级结构有一定的影响,从而对AGO4-1和RDR6起到抑制作用,从而达到抑制系统沉默和DNA甲基化的目的。 综上所述,我们推测2b~(Leu)介导的高致病性是通过其阻止siRNA的系统移动,并抑制AGO4-1和RDR6等沉默因子的表达,来实现病毒高效的系统移动和复制,从而导致寄主表现出严重的病毒症状。
【学位授予单位】:浙江理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S432.41

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【参考文献】
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