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《浙江理工大学》 2011年
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hTER定点突变对细胞生长的影响

翁钰璟  
【摘要】:端粒存在于真核生物染色体末端,由特定的DNA重复序列及与之特异性结合的蛋白质构成。端粒长度随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短,能利用自身RNA模板合成端粒片段的端粒酶可以弥补复制时造成的片段缺失。在端粒功能调控中,还需一类结合蛋白的参与。端粒结合蛋白是特异结合在端粒不同位点并参与端粒各种功能的一类蛋白质的总称。端粒与端粒结合蛋白相互作用,保护染色体不被核酸酶降解,防止染色体末端融合,并克服由于DNA末端的复制缺陷造成的染色体末端缩短,保证了染色体的完整性。 由于端粒酶合成端粒DNA并稳定染色体结构,在端粒功能中起着重要作用。因而定点突变端粒酶近模板序列的位点,可能对端粒酶的功能产生较大影响,对于肿瘤治疗来说具有重要意义和参考价值。 本文通过克隆人端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTER)基因,采用重叠延伸PCR法(overlap extension PCR, OE-PCR)对端粒酶RNA近模板序列碱基A61A62/GG以及G63G64/AA进行定点突变,得到T1和T2两个突变的目的片段。将T1和T2两个目的片段分别与pMD18T载体连接,构建成pMD18-hTER重组质粒。两种连接产物分别转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA后,对重组质粒进行PCR和酶切鉴定。酶切产物纯化后,将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)进行连接,再次转化E.coli DH5α感受态细胞。提取重组质粒,得到pcDNA-hTER片段,经酶切鉴定后,证实载体构建成功。构建真核表达载体的过程中,同时构建一个未突变的端粒酶RNA基因与pcDNA3.1(-)连接而成的重组质粒作为阳性对照,以及pcDNA3.1(-)空载体作为阴性对照。 将T1、T2、阳性对照和阴性对照四个重组质粒转染进HeLa细胞中,经G418筛选后,每种重组质粒均形成了单克隆。对单克隆进行扩大培养,提取其总RNA,逆转录酶PCR法(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)检测到目的基因已整合到HeLa细胞基因组中,说明重组质粒在细胞中稳定表达。 用MTT法对转染了不同重组质粒的HeLa细胞绘制生长曲线。结果表明,T1在一定程度上促进了细胞的生长,而T2在一定程度上抑制了细胞的生长。分析产生该种结果的原因,可能是由于T1突变体使端粒酶与端粒之间的结合变得更稳定,对端粒的合成起到促进作用,而T2突变体减弱了端粒酶与端粒之间的特异性结合,因此对细胞的分裂和生长起到了抑制作用。
【学位授予单位】:浙江理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

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