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10-羟基喜树碱—腺病毒衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

陈文铎  
【摘要】:腺病毒(Adenovirus,Ad)是临床基因治疗中最常见的病毒载体之一,大概占到其中的四分之一。腺病毒载体与其他病毒载体相比,复制能力不高,具有低免疫原、低毒反应、自身基因不整合到宿主基因组等优点;与非病毒载体相比,腺病毒也有高效的转染率。随着近几年纳米材料技术的快速发展,腺病毒载体作为一种新型的纳米材料,不仅仅可以携带外源目的基因,还可以成为药物小分子和抗原、多肽等大分子的载体,从而实现活体成像,药物靶向以及缓慢释放等功能。而喜树碱类药物是临床上治疗肿瘤的有效药物之一,但大部分该类药物因自身复杂的大共轭结构使得其溶解性不好,并且缺乏组织靶向性,对机体也有较大的副作用。作者通过在10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamptothecin,HCPT)的10位、20位羟基引入丁二酸基团来改善HCPT的水溶性,提高内酯环的稳定性;并以丁二酸为链接,与腺病毒衣壳蛋白表面的氨基共价偶联,合成一种新型的喜树碱前体药物—10羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒,并用结肠癌细胞检测其对细胞生长的影响。 首先,将丁二酸酐与10-羟基喜树碱的10位、20位羟基酯化得到喜树碱衍生物—10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱(10,20(S)-O-disuccinyl-Hydroxycamptothecin,DSH),所得衍生物经核磁共振氢谱进行表征;用水浴搅拌法测定DSH在水中的溶解度;采用MTT比色法检测衍生物对结肠癌细胞SW480的生长抑制;琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段,Hoechst33342染色检测样品是否能诱导细胞凋亡。结果表明,丁二酸酐的羧基成功与10-羟基喜树碱的10位、20位羟基酯化;DSH在水中的溶解度(25℃)为2.3mg,溶解度要比10-羟基喜树碱提高约22倍;肿瘤细胞的生长抑制作用呈剂量/时间依赖性,其半抑制浓度(IC50值)为700nM,效果不如10-羟基喜树碱,推测可能是由于20位的丁二酸基团干扰喜树碱内酯环与拓扑异构酶的作用;而琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状图谱,Hoechst33342染色表明喜树碱类衍生物可诱导凋亡。 其次,通过293A细胞大量扩增含有增强荧光蛋白基因的腺病毒Ad5-EGFP,用CsCl梯度离心法纯化该病毒,TCID50法测得腺病毒的滴度,并且在倒置荧光显微镜下观察腺病毒感染结肠癌细胞SW480后荧光蛋白的表达。结果表明,腺病毒的滴度为1×1010pfu,纯化后的腺病毒Ad5-EGFP可以正常的感染肿瘤细胞,而且感染效率较高。 最后,活化DSH的羧基,与腺病毒4℃反应12h,经Sephadex G-25纯化后获得产物10-羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒(DSH-Ad);利用连续波长紫外扫描鉴定复合物,并用DSH回收率法测定DSH与Ad的共价结合分子数;MTT比色法比较DSH-Ad及相应浓度的DSH、HCPT、Ad对结肠癌细胞SW480的生长抑制作用;并在倒置荧光显微镜下观察实验各组分对腺病毒在细胞中荧光蛋白的表达的影响;Hoechst33342染色观察样品对结肠癌细胞株的凋亡诱导情况。结果表明DSH-Ad在腺病毒和10-羟基喜树碱的最大吸收峰260nm、375nm处都有吸收峰,初步表明DSH-Ad的合成成功;经回收率法测的腺病毒与DSH的共价分子结合数为363±24(n=4);MTT比色法说明DSH-Ad对细胞有较明显的生长抑制作用,并且与相对应的10-羟基喜树碱浓度呈相关性,而相同浓度下的DSH对细胞的生长并没有太大影响,推测可能由于DSH-Ad在进入细胞后,DSH中新生成的酯键被水解为10-羟基喜树碱;荧光显微镜下发现DSH-Ad会严重影响荧光蛋白的表达,而单独的各个实验组分对腺病毒的表达没有太大的影响,表明DSH在与腺病毒同时进入细胞后会干扰荧光蛋白基因与宿主细胞基因组的整合。Hoechst33342染色后发现细胞出现明显的凋亡小体。本实验中构建的共价偶联物即有喜树碱对细胞的有效杀伤作用,又有腺病毒的双靶向性的优点,又改善喜树碱的溶解性和内酯环的稳定性,增加抗肿瘤效果,为开发这一类共价偶联物应用于肿瘤治疗提供必要的实验依据。


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