应用昆虫细胞表达系统生产用于基因治疗的重组腺相关病毒的研究

【摘要】：与其他病毒载体相比，腺相关病毒（adenovirus-associated virus, AAV）由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达时间长等优势而成为目前最有前景的基因治疗载体之。尽管AAV载体具有众多优势，但AAV的生产是个比较繁琐的过程，涉及到的因素比较多，如何获得种简单而高产量的生产方式直是阻碍其在临床上应用的大瓶颈。 随着科研人员的不断探索，AAV的生产方式经历了几个不同的发展阶段，因此AAV的生产成本在不断降低，产量却逐步提高，从而能够实现AAV规模化生产的目标。目前除腺病毒和单纯疱疹病毒外，杆状病毒也能为AAV的复制包装提供辅助功能，而且杆状病毒安全有效且不会感染人体。因此，利用杆状病毒携带AAV包装所需的顺式和反式作用元件，通过对昆虫细胞Sf9的感染，在昆虫细胞中生产重组AAV载体，是种较为理想的生产方式且能够规模化生产重组AAV。 重组AAV生产的昆虫细胞表达系统需要两类反式因子和个顺式元件。反式因子包括AAV的复制和整合所需蛋白Rep78和Rep52，以及AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。两类反式因子可由种杆状病毒携带。顺式元件为携带AAV的ITR及外源基因表达框（如EGFP），可由另重组杆状病毒提供。 本研究，我们借助个能在昆虫细胞中起作用的包含昆虫多角体蛋白启动子的内含子，将AAV的rep和cap基因构建到同杆状病毒载体中，借助内含子的作用，Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52，而Cap表达框能同时表达Cap1、Cap2和Cap3。此外，我们设计了另种生产AAV策略，即将rep和cap编码基因起始密码子进行突变，构建的杆状病毒载体也能够使Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52，而Cap表达框能同时表达Cap1、Cap2和Cap3。 根据AAV2的Rep和Cap基因序列设计引物，PCR扩增包括内含子的RepIN、CapIN和起始密码子突变的mRep、mCap。然后将RepIN和CapIN，mRep和mCapIN分别构建到同杆状病毒穿梭载体pFastBacDual中得到pFBD-RC和pFBD-mRC。将这两个载体分别转化DH10Bac~(TM)感受态细胞通过转座得到重组Bacmid，转染sf9细胞后生产出重组杆状病毒Bac-RC和Bac-mRC。采用类似的方法也得到重组杆状病毒Bac-EGFP和Bac-TRAIL。将Bac-RC和Bac-EGFP/Bac-TRAIL、Bac-mRC和Bac-EGFP/Bac-TRAIL分别共感染Sf9细胞构成二杆状病毒生产系统，可分别用来生产携带EGFP和TRAIL的重组病毒AAV-EGFP和AAV-TRAIL。 研究初步表明，上述两种生产AAV的策略均能成功包装出AAV-EGFP和AAV-TRAIL病毒。生产出的病毒经AAV纯化试剂盒纯化，通过定量PCR检测病毒载体基因组产量，结果显示采用内含子连接的二状病毒系统生产重组AAV的能力为每个Sf9细胞1.32×10~4VG（Virus vector genomes，病毒载体基因组），而突变起始密码子的二杆状病毒则每个Sf9细胞产生2.1×10~3VG。可见Bac-RC与Bac-EGFP的二杆状病毒系统的生产能力更强。重组AAV-EGFP感染293A细胞后能观察到较强的绿色荧光表达，表明病毒活力较好。上述两种利用杆状病毒生产重组AAV的能力均较强，达到传统生产方法产量的10倍以上，后续如将其放大到较大规模的悬浮培养生产方式，产量和生产效率将得到极大提高。因此，杆状病毒生产重组AAV系统具有高效、安全、可放大特性并且生产过程简单，能够满足临床基因治疗对AAV产量的需求，且生产的AAV病毒与传统哺乳动物细胞生产的没有任何区别。

【关键词】：AAV载体 昆虫细胞表达系统 重组杆状病毒 AAV-EGFP/AAV-TRAIL
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q96
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