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《浙江理工大学》 2012年
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家蚕BmAGO1基因的克隆、表达及其功能的初步研究

高珍  
【摘要】:RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)是一种包含Argonaute(AGO)等蛋白的核糖核蛋白复合物,其能结合成熟microRNA(miRNA),介导mRNA靶标基因的转录后基因沉默或降解,从而参与基因的表达调控。AGO家族蛋白是RISC复合体的核心,是miRNA功能途径中的关键蛋白,其能够结合miRNA以及剪切靶标基因,在生物的生长发育过程起重要的作用。同时,利用AGO蛋白抗体免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA靶基因的主要方法,其研究已经备受关注。从家蚕cDNA文库中筛选到一条序列,生物信息学分析发现该序列含一个2739 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码一个由912个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为101.5 kDa,等电点为9.26。由于其所编码的蛋白含有两个完整的PAZ和PIWI保守结构域,且与其他物种中的AGO1蛋白有很高的同源性,故将该基因命名为BmAGO1(GenBank登录号:NM_001102461)。通过DNAStar软件进行抗原表位分析获得BmAGO1蛋白的表面抗原区Kago-1,PCR扩增Kago-1片段并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组原核表达载体pET-28a(+)-Kago-1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,在27 kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,并以包涵体的形式存在,与预期值(融合标签3.56 kDa,Kago-1 23.99 kDa)相符,经质谱鉴定正确。镍柱亲和层析纯化His标签融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1:25600以上,且Western blotting检测抗体特异性良好。提取家蚕各发育时期和五龄期各组织的总蛋白,Western blotting检测BmAGO1在家蚕各时期和各组织的表达情况。结果表明,BmAGO1在家蚕卵、蛹、蛾和五龄幼虫期都有表达,但表达水平存在差异,在蛹期表达量最高,卵期最少。在五龄幼虫各组织中BmAGO1的表达差异也很明显,该蛋白在头和皮中表达量较高,丝腺和马氏管中也有少量表达,在其它组织中没有检测到明显的表达。由于AGO蛋白为miRNA功能途径的关键蛋白,上述表达谱分析表明家蚕蛹期与五龄幼虫的头和皮组织中的基因表达可能存在较为活跃的miRNA调控。此外,亚细胞定位分析表明,BmAGO1蛋白主要存在于细胞质中,进一步RNA干扰下调BmAGO1在BmN细胞中的表达,MTT法检测干扰前后细胞活力,结果表明,RNA干扰后的细胞活力上升;流式细胞仪分析显示,与对照组相比,干扰后S期细胞数量升高,说明BmAGO1及其结合的miRNA可能参与细胞周期的基因调控。AGO蛋白结合RNA中存在miRNA及其靶基因的mRNA,因此AGO蛋白免疫沉淀分离结合RNA是规模化鉴定miRNA靶基因的有效方法。我们采用两种方法分离AGO蛋白结合RNA:(1)用上述制备的抗体免疫沉淀家蚕组织中天然AGO蛋白并分离结合RNA。由于BmAGO1蛋白在家蚕头和皮中表达量很高,用制备的多抗在上述组织中免疫共沉淀得到RNA/蛋白复合物,并分离得到结合RNA,以家蚕潜在miRNA靶基因BmEm4和Bm(spl)-like和BmEmc为测试基因,经过荧光定量PCR鉴定发现,和提取的组织总RNA相比,BmEm4、Bm(spl)-like和BmEmc基因在家蚕组织BmAGO1结合RNA的富集倍数分别为3.52倍、1.56倍和0.75倍;(2)将AGO蛋白在家蚕细胞中与HIS标签融合表达,用HIS单抗免疫沉淀HIS融合AGO蛋白并分离结合RNA。将BmAGO1基因ORF克隆到真核表达载体pIEx-1上构建真核重组表达载体pIEx-1-BmAG01,重组质粒通过脂质体介导法转染家蚕细胞,Western blotting鉴定结果显示BmAGO1在家蚕细胞中成功表达。用HIS单抗免疫共沉淀BmAGO1融合蛋白得到RNA/蛋白复合物,分离结合的RNA,同样以BmEm4、Bm(spl)-like和BmEmc为测试基因,经过荧光定量PCR鉴定发现,BmEm4、Bm(spl)-like和BmEmc在家蚕细胞BmAGO1结合RNA中的富集倍数分别为5.04倍、1.08倍和0.63倍。上述结果表明,BmAGO1结合RNA中存在较高水平的BmEm4和少量的Bm(spl)-like。前期研究显示,BmEm4基因的3' UTR存在保守的miR-7和miR-79结合位点,这进一步证实了 BmEm4为miRNA调控靶基因。目前还没有家蚕miRNA靶基因鉴定的相关工作,BmAGO1结合RNA的有效分离为家蚕miRNA靶基因的规模化鉴定打下基础。
【学位授予单位】:浙江理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S881.2

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