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《浙江海洋学院》 2012年
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分子标记在褐牙鲆耐高温品系选育中的应用

李三磊  
【摘要】:本文利用扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP),微卫星和线粒体序列分析技术分析了褐牙鲆青岛和舟山野生群体的遗传结构,了解两个野生群体的遗传学信息,为褐牙鲆的耐高温选育时亲本的选择提供参考;通过高温刺激(32℃)获得褐牙鲆的耐热群体和热敏感群体,利用AFLP和微卫星标记技术筛选与褐牙鲆耐热相关的分子标记,并分析了两个群体的遗传多样性;而且,以褐牙鲆的耐热群体和热敏感群体为材料,分析了褐牙鲆HSP70基因序列的多态性位点,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对其中6个位点进行检测,并对这6个位点的多态性与褐牙鲆的耐热性的相关性进行分析,旨在寻找与褐牙鲆耐热性显著相关的分子标记,以期为褐牙鲆耐高温选育提供技术支持。研究结果如下: 采用10对AFLP引物共产生390条条带,多态片段比例为87.44%。青岛群体和舟山群体扩增得到的多态片段数目分别为279和204,多态性比例分别为72.85%和56.35%。青岛群体的Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息指数分别为0.243和0.364;舟山群体为0.189和0.284。两群体间的遗传距离和遗传分化系数分别为D=0.0849和Fst=0.195(P 0.001),两群体间存在显著的遗传分化。采用10对多态性的微卫星引物,两个群体共检测到68个不同的等位基因,10个位点的平均等位基因数在2~9之间,基因型数在3~45之间。青岛群体的平均等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为6.100、0.733和0.779,舟山群体为6.300、0.708和0.783。青岛群体有5个位点偏离哈代-温伯格平衡,舟山群体有4个位点偏离哈代-温伯格平衡。两个群体的遗传距离和遗传分化系数分别为D=0.281和Fst=0.0363(P=0.0001),两群体间存在显著的遗传分化。在COⅠ序列分析中,两个群体检测到25个变异位点,定义15个单倍型;青岛群体的单倍型数为10个,舟山群体的单倍型数为7个;青岛群体的单倍型多样性和核苷酸多样性为0.746±0.0728和0.00334±0.00103;舟山群体为0.712±0.0470和0.00318±0.00049;两群体间遗传分化系数为Fst=0.128(P 0.001),群体间存在显著的遗传分化。 通过高温刺激(32℃)获得褐牙鲆的耐热群体和热敏感群体,利用81对AFLP引物组合和42对微卫星引物筛选褐牙鲆耐热相关分子标记,并分析了两个群体的遗传多样性。1个AFLP位点(A3)在热敏感群体中出现的频率显著高于耐热群体,与耐热性存在显著的负相关(P 0.01),相关系数达到-0.453;4个AFLP位点在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体,与耐热性存在显著正相关性(P 0.01);微卫星引物Po25A和205TUF扩增出的位点S1和S2与耐热性存在显著负相关性(P 0.01),相关系数分别为-0.408和-0.398。群体遗传多样性分析表明耐热群体与热敏感群体的遗传变异水平较高,两个群体的遗传多样性水平相当。 从4个敏感个体和4个耐热个体得到的PCR扩增产物连接、转化、测序。每个PCR产物测序2个阳性克隆,共测序16个阳性克隆,对所的序列进行拼接获得全长约4000bp的Hsp70基因序列,包含长约830bp的5’非翻译区(UTR),翻译编码区含有8个外显子和7个内含子。Hsp70基因序列含有51个单核苷酸多态性(SNP)位点和6处插入缺失(I/D)位点,5’UTR区域含有19处SNP位点和3处I/D多态性位点,内含子区域含有20处SNP位点和3处I/D多态性位点,外显子区域含有12处SNP位点,全部为同义性突变,不能引起氨基酸的变化。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对其中4个SNP位点和2个插入/缺失位点(snp1:-697C-A,snp2:-587C-G,snp3:-324TTT ins-del,snp4:I2-67T-A,snp5:E4-524C-T和snp6:I4-73ins-del)进行耐热群体相关性分析。结果发现所涉及位点的等位基因和基因型的观察值和期望值吻合良好,符合Hardy-Weinberg平衡定律。其中,位点snp2:Q--587,等位基因G在耐热群体中出现的频率为41.0%,在热敏感群体中出现的频率为30.5%,两者之间具有显著差异(P=0.028)。基因型Q--587G/G在耐热群体中的分布频率为16.0%,在热敏感群体中的频率为4.00%,两者之间具有显著地差异(P=0.005)。位点snp04(I2-67T-A)位点的等位基因A和C在耐热组和热敏感组间的分布差异具有统计显著性(P 0.05),此位点的基因型A/A, A/T和T/T在耐热群体中出现的频率和在热敏感群体中出现的频率具有明显的差异(P=0.0020,0.0020和0.0010)。基因型A/C,C/C和C/T在耐热群体中均有少量分布,而在热敏感群体中没有分布。结果表明,位点snp02和snp04的多态性与褐牙鲆的耐热性具有一定的相关性,在褐牙鲆耐高温选育中可以作为候选的分子标记。
【学位授予单位】:浙江海洋学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S961

【参考文献】
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