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《浙江海洋学院》 2012年
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大黄鱼IGF-Ⅰ基因的克隆及原核表达研究

郑孝亮  
【摘要】:胰岛素样生长因子(insuline-like growth factors, IGFs)是一类代谢功能与胰岛素相似的单链多肽,它们与胰岛素原在结构上也类似,与胰岛素原的氨基酸序列大约有50%的同源性。胰岛素样生长因子的家族由IGF-Ⅰ和Ⅱ。主要起刺激生长和分化的作用,在渗透压调节、繁殖、生命周期、骨质平衡、免疫应答和新陈代谢等方面也具有重要的生理功能。血清中IGFs含量很少且与其载体结合存在所以提取天然活性IGFs蛋白非常困难。 随着鱼类IGFs系统研究的不断深入,获得有活性IGFs蛋白显得非常重要,本研究在克隆大黄鱼(Pseudosciaena crocea)IGF-Ⅰ的基础上,运用大肠杆菌原核表达系统对大黄鱼IGF-Ⅰ基因进行体外表达。 采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5'非翻译区、1409bp的3'非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7500Da,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。 以pET-28a为载体,构建了IGF-Ⅰ的原核表达质粒,并成功在大肠杆菌中表达了含6个组氨酸标记的大黄鱼IGF-Ⅰ重组蛋白,SDS-PAGE表明大黄鱼IGF-Ⅰ的重组蛋白分子量为24kDa,与预期大小一致。
【学位授予单位】:浙江海洋学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q78

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