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《浙江农林大学》 2012年
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光皮桦组织快繁及转基因体系建立

孙晓敏  
【摘要】:本文系统地研究了光皮桦组织培养快速繁殖与转基因技术体系。分别以茎段和叶片为试验外植体材料,采用正交试验设计和完全组合试验设计,建立并优化了光皮桦组织培养快速繁殖体系。在此基础之上,利用正交试验设计,以光皮桦组培苗叶片为受体材料,通过GUS基因瞬时表达染色确定遗传转化率,研究了不同预培养时间、菌液浓度、AS浓度、浸染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对光皮桦遗传转化的影响,并研究探讨光皮桦转化中添加羧苄青霉素与卡那霉素的适宜浓度,初步建立了农杆菌介导的高效光皮桦遗传转化体系。该试验结果为光皮桦的优良品种快繁建立了技术平台,同时为光皮桦遗传转化体系建立提供了重要的技术基础。 高效且稳定的组培快繁体系的建立是获得高频的遗传转化效率的基础。本试验以光皮桦茎段、叶片为外植体,系统地研究了不同基本培养基、不同浓度植物生长调节剂组合对诱导芽分化及再生苗生根的影响,采用“一步成芽”的方法(茎段、叶片直接产生丛生芽),无需芽增殖阶段,平均芽数可达到5.43个和12个,分化率为99.85%和80%,大大提高了试验效率;建立及优化光皮桦的组培快繁体系、建立了光皮桦遗传转化体系。 1.光皮桦茎段、叶片在MS培养基上,诱导的不定芽最多,且芽生长状况良好,颜色深绿;故选择MS基本培养基为光皮桦高效再生的最佳基本培养基。 2.本次试验中,以光皮桦茎段为外植体,对不定芽诱导芽分化培养基中添加TDZ、6-BA和TDZ、6-BA与NAA两种不组合激素组合进行对比。结果表明,光皮桦茎段在诱导芽分化阶段,只添加细胞分裂素6-BA、TDZ,能促进诱导芽分化,生长素NAA对芽分化率无显著影响。 3.光皮桦以茎段为外植体的最佳不定芽诱导分化培养基为MS+0.50mg·L~(-1)6-BA+0.10mg·L~(-1)TDZ+30mg·L~(-1)蔗糖+5.50g·L~(-1)琼脂,在该培养基上丛生芽分化率高达99.85%,平均诱导芽数为5.43个。 4.光皮桦以叶片为外植体的最佳不定芽诱导分化培养为MS+TDZ1.0mg·L~(-1)+NAA0.05mg·L~(-1)+蔗糖30g·L~(-1)+琼脂5.5g·L~(-1),在该培养基上叶片丛生芽诱导率可达到80.00%,平均不定芽数高达12个,且芽生长健壮,呈深绿色。 5.在光皮桦再生苗生根阶段,在以1/2MS培养基为基本培养基的前提下,对激素IBA与NAA进行对比试验,最终筛选出:激素IBA比NAA更适于光皮桦的生根培养。 6.光皮桦最佳再生苗生根培养基为:1/2MS+IBA1.0mg·L~(-1)+蔗糖20g·L~(-1)+琼脂5.5g·L~(-1),在该培养基上再生苗的生根率达100%,平均根数为14.5个,平均根长为10~11cm,根较粗壮,基部无愈伤组织,且产生了很多毛细根。 7.光皮桦叶片的Hyg抗性比较敏感,在不含潮霉素的不定芽诱导分化培养基上不定芽分化率可达80%,且不定芽生长状况良好;而当不定芽在含潮霉素20mg·L~(-1)的不定芽诱导分化培养基上,则渐渐变黑死亡。因此本次试验选择20mg·L~(-1)Hyg作为光皮桦叶片遗传转化的Hyg合适筛选浓度。 8.当羧苄青霉素浓度为400mg·L~(-1)可以完全抑制农杆菌EHA105的生长,且完全不影响诱导不定芽的发生率。 9.农杆菌介导的高效光皮桦遗传转化体系建立。试验结果表明,光皮桦无菌组培苗叶片预培养7d、菌液浓度吸光度OD600测定值为1.0、侵染时间为20min、农杆菌液侵染时添加乙酰丁香酮(AS)的浓度为200μmol·L~(-1)、共培养5d为最佳遗传转化体系,最佳瞬时表达率为98%。
【学位授予单位】:浙江农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S792.15

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