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《浙江农林大学》 2016年
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靶向猪CLTC基因的miRNA对乙脑病毒侵入Pk15细胞作用的研究

王亚莉  
【摘要】:乙型脑膜炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)为虫媒病毒,属于黄病毒科。能够在世界范围内引起严重的急性脑膜炎疾病。猪是乙型脑膜炎病毒的贮存宿主,猪-蚊-猪,猪-蚊-人的循环传播严重威胁着人类的健康,同时乙型脑炎病毒还可以造成母猪的流产或者死胎以及公猪的睾丸炎疾病,对畜牧业造成极大的经济损失。microRNA是一类内源性的长度约20-23nt的一类非编码RNA,在基因的转录后调控中发挥着重要的作用,越来越多的研究表明,宿主miRNA具有抗病毒感染的作用。不同的病毒侵入不同的细胞需要不同的入胞途径,其中,网格蛋白介导的包吞途径研究的较为清楚,网格蛋白最基本的亚单位是由三个重链和三个轻链组成,相关研究报道,乙型脑炎病毒通过网格蛋白介导的胞吞途径侵入猪肾上皮细胞系PK15,所以本项目拟以猪CLTC基因的转录后调控为切入点,鉴定靶向猪CLTC基因的miRNA,并探究miRNA-clathrin包被小窝通路在乙型脑膜炎病毒侵入PK15细胞中的作用机制。本研究通过生物信息学的方法初步筛选出靶向猪CLTC基因的6条ssc-miRNA mimics,并进一步使用双荧光素酶检测试剂盒,Western Blot技术以及实时荧光定量PCR的方法验证出靶向猪CLTC基因的ssc-miRNA mimics,试验将miRNA与猪CLTC基因的配对碱基突变作为阴性对照,明确证实了靶向猪CLTC基因的ssc-miRNA mimics,并进一步验证了miRNA与猪CLTC基因的靶向机理。采用实时荧光定量PCR的方法检测靶向猪CLTC基因的miRNA对乙型脑膜炎病毒侵入猪PK15细胞的影响。同时,利用实时荧光定量PCR的方法检测敲低CLTC基因表达后对乙型脑膜炎病毒侵入猪PK15细胞的影响。最后,乙型脑膜炎病毒感染猪PK15细胞以后利用实时荧光定量PCR的方法探索不同时间点miRNA和其靶基因CLTC的表达变化规律。试验结果表明:实时荧光定量PCR,Western Blot技术以及双荧光素酶检测试验相结合,验证了靶向猪CLTC基因的2条miRNA mimics,分别是:ssc-mi R-1和ssc-miR-129-5p;利用点突变试验证实ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p能够靶向猪CLTC基因,且ssc-mi R-1通过碱基配对与猪CLTC基因互补结合,完全遵循“种子规则”。而ssc-miR-129-5p抑制猪CLTC基因的表达没有遵循“种子规则”,不具有物种保守性;定量检测结果表明,靶向猪CLTC基因的miR-1和mi R-129-5p能够抑制乙型脑膜炎病毒对猪PK15细胞的入侵;乙型脑膜炎病毒感染猪PK15细胞后不同时间点检测ssc-miRNA mimics的表达变化,发现各ssc-miRNA mimics并无显著的表达差异。
【学位授予单位】:浙江农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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