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《浙江农林大学》 2016年
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毛竹生长过程中纤维素合成酶基因的表达模式和功能分析

李秀云  
【摘要】:毛竹是中国主要的用材竹种,纤维素的合成是竹材形成的必要条件。纤维素主要由纤维素合成酶(Cellulose synthase,Ces A)合成,并储存在植物的初生壁和次生壁中。因此,研究纤维素合成酶的结构与功能对毛竹生长发育以及纤维素的利用有重要指导意义。本研究以毛竹生长过程中不同时期的5个高度(10cm、30cm、120cm、600cm、1400cm)的毛竹为研究材料,其中10cm和30cm时为毛竹生长初期,120cm为毛竹生长上升期,600cm左右为毛竹生长盛期,1400cm时毛竹开始抽枝展叶,为生长末期,通过生物信息学方法、生物显微镜观察、透射电镜观察、荧光定量PCR、RNA原位杂交、Western Blot、蛋白质的体外表达等方法研究了毛竹纤维素合成酶基因的表达和功能。所得结论如下:(1)毛竹茎秆结构显微观察表明毛竹生长发育分为四个时期,第一个时期,细胞未分化期,没有明显的组织结构,此时的细胞主要以分裂产生更多的细胞为主。第二个时期,原生结构形成期,有典型的维管束结构出现,但密度较大,结构较小,韧皮部细胞分化不明显,纤维细胞和薄壁细胞的界限不明确。第三个时期,维管束结构成熟期,纤维细胞和薄壁细胞的界限明确,有两个典型的后生木质部导管,韧皮部结构明显。第四个时期,纤维细胞木质化时期,可以看到纤维细胞周围一层深色物质。基部的纤维组织最先出现木质化,此时为毛竹生长的上升期,茎秆的高度大约为120cm。(2)毛竹韧皮部细胞超微结构观察发现,毛竹生长发育过程可分为初生壁形成期,次生壁形成期,以及次生壁加厚期。研究表明次生壁随着高度的增加而加厚,上升期(120cm)的毛竹基部可观察到次生壁出现,盛期(600cm)的毛竹中部和基部有次生壁结构,顶部和根部仅有初生壁,末期(14m)毛竹基部次生壁比盛期厚。(3)生物信息学分析表明,毛竹纤维素合成酶家族基因共有16个成员,结构域分析表明,毛竹纤维素合成酶都含有cellulose_synt结构域,N端大多有Zn指结构,毛竹纤维素合成酶超家族成员有48个,分为5个亚家族,分别是CESA、CSLD、CSLE、CSLF、CSLH。系统进化分析表明,Ces A基因极有可能在单、双子叶植物分化前就已经出现分化。祖先状态时,毛竹中的纤维素合成酶基因就比拟南芥和水稻多。物种分化之后,毛竹纤维素合成酶基因也单独发生了多次重复事件,产生了更多的基因拷贝数,这可能和毛竹独特的快速生长特性有关。(4)在前人对毛竹茎秆中纤维素含量的研究基础上,结合显微和超微观察结果以及定量表达结果进行分析发现,在初生壁形成的部位,3个基因(PeCesA6、PeCesA9和PeCesA13)表达最显著。在次生壁形成的部位,毛竹纤维素合成酶基因家族成员的8个基因(PeCesA1、PeCesA2、PeCesA3、PeCesA4、PeCesA5、PeCesA6、PeCesA9、和PeCesA13)表达均非常显著。推测PeCesA6、PeCesA9、PeCesA13对初生壁和次生壁的形成都起到重要作用,而PeCesA1、PeCesA2、PeCesA3、PeCesA4、PeCesA5基因主要参与毛竹次生壁的合成。(5)毛竹纤维素合成酶保守结构域体外表达的蛋白为包涵体,经Western blot检测后确定为该蛋白的表达,表达产物的分子量为33KDa,p I为7.4。
【学位授予单位】:浙江农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2;S795.7

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