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《浙江农林大学》 2017年
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单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白TrxA介导的感染机制研究

董志梅  
【摘要】:单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰氏阳性、食源性胞内寄生菌,可穿过宿主胃肠道屏障、血脑屏障、胎盘屏障引起脑膜炎和流产等,致死率高达30%。单增李斯特菌发挥其致病机制需要一系列毒力因子的参与,从而破坏宿主的免疫防线和应激修复系统。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一类广泛存在于细菌中的氧化还原蛋白,与细菌的抗氧化应激相关,且能够通过二硫键修饰参与蛋白质的折叠从而维持蛋白质功能。生物信息学分析显示单增李斯特菌可能编码含有一个硫氧还蛋白(Trx A,由lmo1233基因编码)。那么,李斯特菌作为重要的胞内寄生菌是否也利用TrxA抵抗体内外环境中的氧化应激并维持其氧化还原稳态?是否参与了重要功能蛋白的折叠修饰?因此,本研究重点探索了单增李斯特菌在适应体外环境及感染宿主过程中利用Trx A介导细菌抗氧化应激的生存机制;揭示了Trx A通过对重要毒力因子的氧化折叠修饰并协助细菌发挥致病力的分子机理;阐明了Trx A与细菌关键鞭毛调控蛋白MogR和GmaR的互作关系并介导细菌鞭毛形成的内在机制。本论文研究发现:(I)单增李斯特菌TrxA在巯基特异性氧化剂肼(diamide)的诱导下其蛋白表达水平极显著上调(P0.001),缺失trxA后细菌在该氧化环境下的生长和存活能力极显著削弱(P0.001),说明Trx A对于李斯特菌的抗氧化应激至关重要;(II)体外原核表达并纯化TrxA后发现该酶具有经典的硫氧还蛋白酶活性,可以高效且特异地将氧化态胰岛素(insulin)还原。在生物信息学分析基础上,通过氨基酸点突变技术将TrxA的两个可能关键氨基酸Cys28和Cys31分别突变成Ala后该酶活性均完全丧失,该结果首次证实李斯特菌TrxA亦属于经典的硫氧还蛋白酶家族,其中Cys28和Cys31为其关键氨基酸位点,决定了该酶的活性和功能;(III)细胞感染试验发现,缺失trxA后细菌在人肠道上皮细胞Caco-2上的黏附、侵袭及存活能力均显著削弱(P0.01),值得关注的是,利用共聚焦荧光显微技术发现缺失株在感染Caco-2过程中招募宿主肌动蛋白Actin的能力明显受限,从而导致细菌无法在其两端形成粗壮的“彗星状尾巴”,造成其在细胞间的迁移能力显著降低(P0.01),证明硫氧还蛋白Trx A对于李斯特菌在胞内感染和生存发挥了关键的作用。体内感染小鼠发现,trxA缺失或过表达均导致细菌在肝脏和脾脏中的复制及增殖水平显著降低(P0.01),进一步研究表明Trx A在体内的表达水平受转录因子SigH严谨调控,证实Trx A介导的氧化还原平衡对于细菌发挥致病力尤为关键;(IV)利用全基因组转录谱测序发现,缺失trxA后共有270个基因的转录水平发生了显著变化(差异2倍以上),其中李斯特菌重要毒力基因plcA,mpl,actA,hly和plcB的转录水平下降尤为显著(P0.01)。利用RT-PCR和Western blot验证进一步证实TrxA确实参与了对该些毒力因子的转录和表达调控。利用等温滴定量热(ITC)试验研究发现,TrxA与李斯特菌毒力中枢调控蛋白PrfA(单体含有4个半胱氨酸)在体外能够发生明显的放热式互作(K=4.00E±1.13E4M-1),推测Trx A参与了PrfA单体分子内二硫键的形成,进而折叠成具有正确结构的二聚体并发挥正常功能,该结果证实TrxA通过对PrfA的氧化还原修饰进而调控下游毒力因子的表达,从而最终介导李斯特菌的致病力。(V)体外运动试验发现,李斯特菌缺失trxA后导致其运动性完全消失,通过电镜观察证实缺失株无法形成鞭毛。ITC试验发现,TrxA在体外能够与鞭毛形成重要蛋白MogR(单体含有2个半胱氨酸)发生吸热式互作(K=1.28E±1.56E4M-1),表明TrxA可能也参与了单增李斯特菌鞭毛形成的相关蛋白修饰及功能维持。因此,本项目首次运用生物信息学、分子生物学、蛋白质组学、感染生物学和细胞生物学等手段,探索了单增李斯特菌硫氧还蛋白Trx A在细菌体内外环境中的抗氧化应激机制,以及在感染宿主过程中通过对重要毒力因子的氧化还原修饰而参与细菌致病过程的分子机理,首次揭示了该蛋白通过对鞭毛调控蛋白MogR的修饰并介导细菌鞭毛形成及运动的分子机制。本研究对于揭示单增李斯特菌在体外氧化应激环境、宿主体内的抗氧化生存、二硫键稳态维持及氧化还原修饰机理以及维护人和动物健康具有重要意义。
【学位授予单位】:浙江农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;R378

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 马宇光;杨帆;杨卫军;;硫氧还蛋白的结构及在生物抗氧化中的功能[J];生命的化学;2011年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 陈信;陶金忠;杨佐青;马瑞华;;奶牛妊娠黄体蛋白组学研究[J];黑龙江畜牧兽医;2017年01期
2 陆宁;陈剑成;郑郁善;;凹叶厚朴低温胁迫SSH文库的构建及差异基因的表达分析[J];安徽农业科学;2016年14期
3 刘功成;王作伟;李亭亭;杜金莹;杜小刚;曹晓涵;曾宪垠;;重楼叶多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力[J];食品工业科技;2015年16期
4 谢香荣;李双农;武圣洁;;老年人血清硫氧还蛋白和3-硝基酪氨酸与糖尿病视网膜病变相关性研究[J];中华老年医学杂志;2014年12期
5 刘泓宇;谭北平;董晓慧;迟淑艳;杨奇慧;;低盐胁迫下凡纳滨对虾鳃丝抑制性消减杂交cDNA文库构建及差异ESTs分析[J];海洋湖沼通报;2014年01期
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1 沙拉麦提·吐尔逊太;高涛;阿依夏木;于烽;;李斯特菌及其危害研究进展[J];地方病通报;2006年02期
2 刘柳;孔保华;崔畅;;单核细胞增生性李斯特菌的增殖和抑制[J];肉类研究;2006年05期
3 陈健舜;江玲丽;方维焕;;李斯特菌毒力因子及其进化[J];微生物学报;2007年04期
4 陆平成;;李斯特菌引起的新问题[J];国外医学(微生物学分册);1989年05期
5 朱献忠;;单核细胞增生性李斯特菌研究进展[J];中国卫生检验杂志;2007年07期
6 谢琦;杨吉霞;;肉制品中李斯特菌的预防控制技术研究进展[J];中国科技信息;2008年24期
7 高琪;单核细胞增多性李斯特菌检测新技术[J];解放军预防医学杂志;1991年04期
8 李郁,魏建忠,王桂军;产单核李斯特菌的研究进展[J];中国卫生检验杂志;2005年08期
9 何冬梅;邓峰;赖蔚苳;严纪文;宋曼丹;朱海明;柯昌文;马聪;;单核细胞增生李斯特菌生物学研究进展[J];华南预防医学;2006年06期
10 张艳超;雷应;杜臻嘉;;李斯特菌比对试验分析与探讨[J];检验检疫科学;2007年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 马保华;张辉华;吕平;曹永长;毕英佐;;李斯特菌套式PCR快速检测方法的建立及初步应用[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
2 李郁;魏建忠;王桂军;;李斯特菌与食品安全[A];食品安全的理论与实践——安徽食品安全博士科技论坛论文集[C];2005年
3 刘晶;;10例孕产妇感染李斯特菌的特点及药敏分析[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年
4 王芳;于力;;李斯特菌研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年
5 杨世萍;李静;;1例产妇感染李斯特菌报道[A];全国妇产科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2007年
6 王红;陈燕梅;张正东;;2005-2007年自贡市食品中单核细胞增生李斯特菌污染状况的调查[A];“环境与健康”学术研讨会论文摘要集[C];2007年
7 王怡净;;李斯特菌引起的食物中毒及其防治[A];四川省营养学会2002年学术会议专题报告及论文摘要汇编[C];2002年
8 朱敏丽;林振浪;;新生儿李斯特菌败血症2例[A];2009年浙江省围产医学学术年会暨“围产医学热点问题”专题学术论坛论文汇编[C];2009年
9 吴旭琴;;G12-type对M3乙酰胆碱受体介导的PLD调控研究[A];中华医院管理学会第十一届全国医院感染管理学术年会论文汇编[C];2004年
10 刘晨临;黄晓航;Lee Yookyung;李光友;;日本凋毛藻Griffithsia japonica的硫氧还蛋白研究[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 冯卫东;加推动李斯特菌基因组序列研究[N];科技日报;2013年
2 林晓丽;广州鲈鱼检测项目尚不包含李斯特菌[N];广州日报;2007年
3 中国疾病预防控制中心研究员 叶长芸;冰箱杀手李斯特菌[N];北京日报;2009年
4 叶圣琳;李斯特菌来势猛,英国老年人“中招”多[N];新华每日电讯;2009年
5 杜鹃;美国:香瓜染李斯特菌,死十余人[N];新华每日电讯;2011年
6 本报记者 聂国春;专家:警惕冰箱里的杀手[N];中国消费者报;2011年
7 陈继培;慎防“李斯特病”[N];广东科技报;2000年
8 陈倩;食品真空包装并非万无一失[N];健康报;2007年
9 顾皓行;澳研究使用噬菌体降低李斯特菌污染风险[N];中国食品报;2011年
10 本版编辑 赵志刚  杨帆 陈诚;多国水产品遭遇病菌侵袭[N];中国渔业报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 陈健舜;单核细胞增多性李斯特菌分子进化与酸应激功能基因组学研究[D];浙江大学;2010年
2 王玉;吞噬细胞限制李斯特菌增殖的新型防御机制研究[D];第三军医大学;2016年
3 娄军;SNX10在细菌感染中潜在功能的研究[D];浙江大学;2016年
4 贾金婧;硫氧还蛋白-1抵抗环境应答中肾上腺素损伤的分子机理[D];昆明理工大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 董志梅;单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白TrxA介导的感染机制研究[D];浙江农林大学;2017年
2 王毅;建立鉴定李斯特菌种及亚型的多重PCR方法及用于李斯特菌核酸检测的新型恒温扩增技术[D];中国疾病预防控制中心;2015年
3 周敏;新生儿李斯特菌败血症22例临床分析[D];重庆医科大学;2016年
4 李帅;李斯特菌侵染宿主细胞胞内磷脂酶D活性变化的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
5 张晨菊;三株致病性李斯特菌的蛋白质组学研究[D];扬州大学;2010年
6 张晓峰;李斯特菌分子鉴定与分型及其在安全牛奶生产中的应用[D];浙江大学;2002年
7 骆笑凯;单核细胞增多性李斯特菌检测试剂盒优化及其表面蛋白的免疫反应性分析[D];浙江大学;2009年
8 田国明;食源性单核细胞增多性李斯特菌:肽核酸原位荧光检测与LMO1847蛋白免疫原性分析[D];浙江大学;2007年
9 黄丽;单核细胞增多性李斯特菌Lmo0964蛋白功能研究[D];浙江农林大学;2014年
10 赵智慧;新生儿李斯特菌败血症20例临床特征分析[D];泸州医学院;2014年
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