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《浙江农林大学》 2017年
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朵丽蝶兰microRNA172干涉载体构建及其靶基因克隆

王贝贝  
【摘要】:朵丽蝶兰(Doritaenopsis hybrid)作为蝴蝶兰(Phalaenopsis)与朵丽兰(Dorits)的杂交品种,是目前市场上应用最多的商品蝴蝶兰杂交品种之一。它以花期长,花形优雅,色彩艳丽等特点深受人们喜爱。但是其开花需要经历一段18-25℃的相对低温诱导,所以温度成为制约其开花上市的主要原因之一。探究温度调控朵丽蝶兰开花时间的分子机制,是克服温敏现象的关键科学问题。本研究以朵丽蝶兰为材料,利用Gateway技术构建DhMIR172干涉载体,为后续朵丽蝶兰的遗传转化做准备。利用RACE技术克隆DhMIR172候选靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3。为进一步明确DhMIR172及其靶基因在朵丽蝶兰低温成花过程中的重要作用与调控机制奠定基础。主要研究结论如下:1、DhMIR172的RNA干扰表达载体的构建根据RNA干扰原理,利用本实验室已克隆的DhMIR172序列设计Gateway引物,PCR扩增后引入定向连接位点。通过pENTRTM Directional TOPO(?) Cloning Kits试剂盒构建入门载体,再将目的序列定向转移至表达载体pHELLAGATE8,构建DhMIR172 基因 RNA 干扰表达载体 pHELLAGATE8-DhMIR172。以朵丽蝶兰0908原球茎为外植体,用农杆菌GV3101介导转化,以300 mg/L的羧苄青霉素抑制农杆菌生长,壮观霉素抗性培养基筛选再生苗,验证所构建的RNA干涉载体的表达效率。结果发现,恢复培养一星期后,农杆菌爆发,原球茎开始褐化;恢复培养两星期后,原球茎全部褐化死亡。未得到转基因植株。2、靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3全长克隆从小兰屿蝴蝶兰数据库中BLAST得到三个DhMIR172候选靶基因(DhAP2-1、DhAP2-2和DhAP2-3),以朵丽蝶兰cDNA为模板分别克隆靶基因全长。本实验室已克隆得到DhAP2-1中间片段,分别设计引物进行3'RACE和5'RACE全长克隆,选取5'端片段,3'端片段以及中间片段进行基因全长拼接,得到2220bp的朵丽蝶兰DhMIR172靶基因DhAP2-1全长cDNA,含有一个1479 bp的ORF区,编码492个氨基酸,含有两个AP2保守结构域和DhMIR172结合位点。利用PCR技术分别扩增靶基因 DhAP2-2 和DhAP2-3, DhAP2-2 cDNA 全长 1038bp,含有一个 1038 bp 的ORF区,编码345个氨基酸,含有两个AP2保守结构域。DhAP2-3 cDNA全长738bp,含有一个738 bp的ORF区,编码245个氨基酸,含有一个AP2保守结构域。3、双荧光素酶检测DhMIR172与候选靶基因的互作关系。本实验主要检测共转野生型克隆AP2-WT过表达载体和miR172 mimic,共转突变型克隆AP2-MUTA过表达载体和miR172 mimic到293 T细胞后,检测荧光素酶活性。同时以共转野生型克隆AP2-WT过表达载体和NC mimic,共转突变型克隆AP2-MUTA过表达载体和NC mimic,做为对照组进行比较分析。在转染重组载体质粒AP2-1-WT的实验中,与miR172NC组比较,miR172组荧光素酶活性显著下降,。转染重组载体质粒AP2-1-MUTA的实验中,各组荧光素酶活性表达均无显著差异。DhAP2-1与miR172之间在mRNA水平存在明显的互作关系。
【学位授予单位】:浙江农林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S682.31;Q943.2

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