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大肠杆菌mRNA膜周定位对其降解速度的影响

许良  
【摘要】:mRNA转录与降解之间的平衡是调节mRNA丰度、调控基因表达的有效手段,对于生命体实施正常的生理功能具有重要意义。真核生物与原核生物mRNA降解方式包括:内切酶降解、5’→3’方向外切酶降解和3’→5’方向外切酶降解3种方式。细菌中最主要的降解途径是内切酶降解。核糖核酸酶E(Ribonuclease E,RNase E)是参与RNA转录后处理和mRNA降解的重要核糖核酸内切酶,是大肠杆菌mRNA降解途径的关键组成部分。RNase E中存在一个片段(Segment-A,SA),是RNase E与细胞膜结合的必要且充分条件。体内和体外实验的结果均表明该片段的破坏会导致RNase E失去膜结合能力。PUF家族蛋白是一类高度保守的RNA结合蛋白,其包含一个进化上高度保守的RNA结合结构域,能特异性识别、结合特定RNA序列。科学家已经分析出PUF蛋白氨基酸序列与识别核苷酸序列的对应关系,为人工设计PUF蛋白并应用于识别结合特定RNA序列奠定了基础。为了探究大肠杆菌内膜周围mRNA降解速度是否与其它位置有所不同,本研究分别设计了结合ompC和gapA mRNA 3’非翻译区的PUF蛋白,并通过在PUF蛋白氨基端加上内膜定位片段,引导结合对应目标基因序列的PUF蛋白定位到内膜附近,进一步通过分析ompC和gapA mRNA含量与PUF蛋白表达的相关性,得到大肠杆菌胞内mRNA内膜周定位是否影响其降解速度的结论。利用片段SA将PUF蛋白定位至大肠杆菌细胞内膜,并利用绿色荧光蛋白作为信号方便PUF蛋白的定位分析。分别构建PUF1-GFP和SA-PUF1-GFP融合蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中分别诱导融合蛋白表达后,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在大肠杆菌胞内的分布,结果发现SA-PUF1-GFP融合蛋白相较于PUF1-GFP,其在大肠杆菌内所处位置明显更靠近大肠杆菌内膜。此结果说明SA片段发挥了内膜定位功能,成功将PUF1-GFP融合蛋白定位到大肠杆菌内膜。选择合适的大肠杆菌内源目标mRNA分子,并在体外验证PUF蛋白与目标RNA分子的互作。利用定量PCR技术,分析了ompC,gapA,aspC和recA四种基因的mRNA表达水平,确定相对表达量较高且分别主要分布于细胞膜和细胞质的ompC和gapA为mRNA目标分子。分别在ompC和gapA的3’非翻译区(untranslated regions,UTR)中选择合适的序列作为PUF蛋白识别序列,并设计合成PUF5(识别ompC 3’非翻译区5’-GCGGGCCC-3’),PUF6(识别gapA 3’非翻译区5’-AGAGCGAC-3’)核苷酸序列。为了方便后续PUF蛋白与目标寡核苷酸的互作分析,我们设计利用青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)荧光和FAM形成荧光能量共振转移对(FRET pair),一旦他们结合,会产生较明显的信号。我们分别构建PUF5-CFP和PUF6-CFP融合蛋白的原核表达载体,并通过原核表达、纯化获得相应的融合蛋白。为了分析寡核苷酸6-FAM标记与PUF蛋白目标寡核苷酸的距离对其互作的影响,我们设计合成了6-FAM修饰与目标寡核苷酸之间有5,10,15,20和25个腺苷酸的寡核苷酸链(6-FAM-A_(5-25)-GCGGGCCC/AGAGCGAC)。通过PUF-CFP与FAM-寡核苷酸链的FRET实验,结果表明PUF5和PUF6蛋白识别、结合其目标RNA序列,且在识别序列与6-FAM之间间隔10个腺苷酸时亲和力最强,K_d值分别为0.45?mol/L和0.52?mol/L。在大肠杆菌细胞内,分析SA-PUF5和SA-PUF6的表达对目标ompC和gapA mRNA分子含量的影响。分别构建PUF5-GFP,SA-PUF5-GFP,PUF6-GFP和SA-PUF6-GFP四种融合蛋白的原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌胞内大量表达相应融合蛋白,并分析融合蛋白的表达量与目标mRNA分子含量变化的相关性。结果发现IPTG诱导蛋白表达3h后,PUF5-GFP表达量达到总蛋白的18.8%,而ompC含量下降至对照的79.3%,SA-PUF5-GFP表达量达到总蛋白的17.1%,而ompC含量下降至对照的61.2%;PUF6-GFP表达量达到总蛋白的19.0%,而gapA含量下降至对照的84.5%,SA-PUF6-GFP表达量达到总蛋白的17.1%,而gapA含量下降至对照的52.9%。此结果表明,利用SA序列定位至大肠杆菌内膜的PUF蛋白,可能结合目标mRNA分子并将其定位于内膜附近,且因为RNase E在细胞内膜的区域化分布,导致目标mRNA分子ompC和gapA的降解速度加快,含量降低。结论:基于膜定位信号和PUF蛋白特异性结合mRNA分子的特点,我们发现人为将mRNA分子定位至大肠杆菌内膜,可能通过加快其降解速率,降低其含量。此结论对于研究mRNA的胞内降解提供了一个新的视角。


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