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《杭州师范大学》 2011年
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番薯过氧化物酶的纯化及其催化鲁米诺化学发光特性研究

韩凤  
【摘要】:过氧化物酶是一类可催化由过氧化氢参与的氧化各种还原剂的氧化还原酶,广泛存在于各种动物、植物和微生物体内,该酶可应用于酶联免疫测定、诊断试剂、生物传感器、有机合成和污染治理等。 论文以番薯(Ipomoea batatas Lam.)为实验材料,研究了番薯过氧化物酶的分离纯化方法、酶学性质以及其催化鲁米诺化学发光性质。 从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析和Con A Sepharose 4B亲和层析。经纯化的番薯过氧化物酶比活力为6930 U/mg,纯化倍数为165,回收率为17%。SDS-PAGE显示一条带,分子量为34000,RZ值为2。 以愈创木酚作底物对纯化的番薯过氧化物酶酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性。酶反应的最适pH在5.5附近,最适温度为70℃;在pH2.2处保存24小时酶活性都未完全失活,中性偏碱性条件下酶稳定性非常高,60℃保温1 h,酶活力残余60%,番薯过氧化物酶是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶。Fe2+、Fe3+对番薯过氧化物酶有强抑制作用,而Ca2+、Mg2+对其有一定的激活作用,表面活性剂PEG和SDS则对其活性无显著影响;有机溶剂甲醇、丙酮和乙醇对该酶均有抑制作用,抑制作用由强到弱表现为乙醇>丙酮>甲醇。 对番薯过氧化物酶催化鲁米诺化学发光条件进行优化,发现在该酶催化鲁米诺化学发光体系中,Tris缓冲液最适pH为9.0,最适浓度为60 mmol/L;鲁米诺、过氧化氢最适浓度分别为5 mmol/L和4 mmol/L;番薯过氧化物酶浓度最低检测限为5 fmol/L。同其它的阴性植物过氧化物酶一样,番薯过氧化物酶在不依赖于增强剂的条件下催化鲁米诺发光,可以得到稳定的光信号,且灵敏度高,发光时效长;番薯过氧化物酶这一性质结合它本身的高稳定性,使其在化学发光酶联免疫分析中具有极大的应用潜力。
【学位授予单位】:杭州师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q814.1

【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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