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《温州大学》 2016年
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羊栖菜多糖通过Nrf2/ARE信号通路发挥抗衰老作用的初步研究

何丹  
【摘要】:衰老是极其复杂的系统性过程,衰老后的生物体抗氧化系统功能降低,内环境氧化还原反应失衡,并且诱发衰老相关疾病。Nrf2(nuclear factor erythroid2-related factor 2)是抗氧化反应元件的正调控因子,参与调控500多个基因的表达,包括抗氧化酶、解毒酶等基因。与老年个体相比,在长寿个体中有保护作用的Nrf2信号通路整体水平上调,提升了老年个体的防御能力,进而延缓衰老的进程。因此,科学家认为Nrf2是健康长寿的保护者。羊栖菜(Sargassum fusiforme)自古到今都有“长寿菜”的美誉,已有报道表明羊栖菜多糖具有抗氧化等多种生物学功能。但羊栖菜多糖发挥其抗氧化并延缓衰老作用的机制研究还未见报道。本文首先应用热水煮提和冷热水依次煮提的方法获得三种羊栖菜多糖,测定它们的理化性质,并通过体外清除自由基实验对这些多糖的抗氧化活性进行筛选。其次筛选自然衰老小鼠模型,以浓度为100mg/kg/d的羊栖菜多糖溶液,对自然衰老小鼠进行灌胃。选取小鼠肝脏为材料,测定衰老小鼠抗氧化酶类和相关基因等衰老指标的变化和羊栖菜多糖对这些衰老指标的影响,研究羊栖菜多糖是否通过Nrf2/ARE(anti-oxidation response element)信号通路发挥抗衰老作用。通过冷热水依次处理羊栖菜,得到冷提羊栖菜多糖(SFCP)和热提羊栖菜多糖(SFHP);直接通过热水煮提羊栖菜,得到羊栖菜总多糖(SFPS)。根据清除自由基结果显示,三者的糖浓度与清除率呈正相关。三者相比较,SFPS比SFCP和SFHP有更好的清除DPPH自由基能力;然而,三者对于羟自由基的清除能力没有明显区别。SFPS是主要由古洛糖醛酸和岩藻糖等9种单糖组成的硫酸化多糖,含有较多的糖醛酸(41.2%),总糖含量为77.2%。研究表明9月龄小鼠的Nrf2、相关抗氧化酶基因表达量和抗氧化酶活力等显著下降,可以作为自然衰老小鼠模型。羊栖菜多糖灌胃9月龄衰老小鼠,提升了小鼠肝脏Nrf2的表达量和抗氧化系统的功能,包括T-AOC、T-SOD、CAT等的酶活力和GCLC、GCLM、GPx1等抗氧化基因的表达。本研究证明羊栖菜多糖是一种很好的天然抗氧化剂,其通过上调Nrf2/ARE信号通路增强机体的抗氧化能力,进而延缓衰老。
【关键词】:衰老 Nrf2/ARE信号通路 羊栖菜多糖 抗衰老
【学位授予单位】:温州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q946
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-12
  • 第一章 绪论12-20
  • 1. 衰老和抗衰老12-13
  • 2. Nrf2/ARE信号通路13-18
  • 2.1 Nrf2:Keap1的结构和功能13-14
  • 2.2 Nrf2参与防御氧化应激疾病中的作用14-16
  • 2.2.1 超氧化物歧化酶15
  • 2.2.2 过氧化氢酶15-16
  • 2.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶16
  • 2.2.4 单胺氧化物酶16
  • 2.3 天然提取物的抗氧化作用研究16-17
  • 2.4 羊栖菜多糖的研究17-18
  • 3. 论文选题的依据、目的及意义18
  • 4. 本论文研究的内容18-20
  • 第二章 实验材料20-26
  • 1. 实验材料20-23
  • 1.1 实验仪器20-21
  • 1.2 实验试剂和试剂盒21-22
  • 1.3 PCR用到引物信息22-23
  • 2 试剂配制23-26
  • 2.1 溶液配制23-25
  • 2.2 软件及统计学分析25-26
  • 第三章 实验方法26-35
  • 3.1 羊栖菜多糖提取步骤26
  • 3.2 测定羊栖菜多糖清除自由基能力26-28
  • 3.2.1 羊栖菜多糖对DPPH清除自由基测定提取步骤26-27
  • 3.2.2 羊栖菜多糖对羟清除自由基测定提取步骤27-28
  • 3.3 测定羊栖菜多糖的理化性质28-30
  • 3.3.1 测定羊栖菜多糖的单糖组成28
  • 3.3.2 苯酚硫酸法测定羊栖菜多糖的总糖含量28
  • 3.3.3 间羟基联苯法测定羊栖菜多糖的糖醛酸含量28-29
  • 3.3.4 考马斯亮蓝测定羊栖菜多糖的蛋白含量29
  • 3.3.5 离子色谱法测定羊栖菜多糖的硫酸根含量29
  • 3.3.6 羊栖菜多糖的分子量测定29-30
  • 3.3.7 羊栖菜多糖的FT-IR分析30
  • 3.4 实验动物处理步骤30
  • 3.5 测定实验动物衰老指标的变化30-32
  • 3.5.1 测定小鼠肝组织总抗氧化能力(T-AOC)的变化30-31
  • 3.5.2 测定小鼠肝组织总抗氧化能力(T-SOD)的变化31
  • 3.5.3 测定小鼠肝组织过氧化氢(CAT)的变化31
  • 3.5.4 测定小鼠肝组织单胺氧化酶(MAO)的变化31-32
  • 3.5.5 测定小鼠肝组织丙二醛(MDA)的变化32
  • 3.6 提取小鼠肝组织总RNA32
  • 3.7 RT-PCR32-33
  • 3.8 提取小鼠肝组织总蛋白33-34
  • 3.9 Western blot34-35
  • 第四章 实验结果与分析35-48
  • 4.1 羊栖菜多糖清除自由基能力的比较35-36
  • 4.1.1 羊栖菜多糖对羟自由基清除作用35-36
  • 4.1.2 羊栖菜多糖对DPPH自由基清除作用36
  • 4.2 羊栖菜多糖的理化性质分析36-39
  • 4.2.1 羊栖菜多糖红外图谱分析38
  • 4.2.2 小结38-39
  • 4.3 自然衰老动物模型筛选39-43
  • 4.3.1 测定不同月龄小鼠抗氧化能力的变化39
  • 4.3.2 测定不同月龄小鼠Nrf2和Keap1表达的变化39-40
  • 4.3.3 测定不同月龄小鼠Nrf2和Keap1的蛋白水平变化40-41
  • 4.3.4 小结41
  • 4.3.5 测定不同月龄小鼠抗氧化基因表达的变化41-42
  • 4.3.6 小结42-43
  • 4.4 羊栖菜多糖对自然衰老小鼠的影响43-48
  • 4.4.1 测定羊栖菜多糖对自然衰老小鼠抗氧化能力的影响43
  • 4.4.2 小结43
  • 4.4.3 测定羊栖菜多糖对自然衰老小鼠Nrf2和Keap1表达的影响43-45
  • 4.4.4 测定羊栖菜多糖对自然衰老小鼠Nrf2和Keap1蛋白水平的变化45-46
  • 4.4.5 小结46
  • 4.4.6 测定羊栖菜多糖处理后小鼠抗氧化基因转录水平的变化46-47
  • 4.4.7 小结47-48
  • 第五章 讨论48-50
  • 参考文献50-55
  • 附录A55-57
  • 不同月龄小鼠Nrf2、Keap1和抗氧化基因表达的变化55-56
  • 羊栖菜多糖对Nrf2、Keap1和抗氧化基因表达的影响56-57
  • 附录B 中英文对照及英文缩写词表57-58
  • 致谢58-59
  • 在校期间成果及发表论文情况59

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