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《浙江工商大学》 2011年
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厚壳贻贝酶解物的制备及其降血压肽的分离纯化、结构表征

张婷  
【摘要】:贻贝是重要的世界性养殖品种,以新鲜贻贝为主要销售形式,经济效益低;作为传统的滋补食品,贻贝具有较高的营养价值和多种药理功效。本文以厚壳贻贝为原料,采用酶水解技术制备厚壳贻贝蛋白多肽,经超滤、凝胶过滤层析和RP-HPLC、质谱测序等手段对活性肽成分进行分离、纯化、结构表征,并通过体外试验验证,获得厚壳贻贝降血压肽。主要研究结果如下: 分别用碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、中性蛋白酶(Neutrase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶(Trypsin)和复合蛋白酶(Promatex)对厚壳贻贝蛋白进行水解,比较酶解物的水解度DH、蛋白质回收率及ACE抑制率,确定出水解厚壳贻贝蛋白的酶源为碱性蛋白酶;在碱性蛋白酶水解厚壳贻贝蛋白单因素试验的基础上,采用响应面设计进行试验优化,结合各因素对响应值的影响顺序,确定最优酶解条件为[E]/[S]2.18%、pH 8.8,温度55℃,此条件下制备的厚壳贻贝酶解物的ACE抑制率为83.12%。 采用5KD超滤膜对酶解物进行初步分离,收集流出液,所得组分MCP在对ACE抑制的IC50由超滤之前的0.367 mg/mL降为0.308mg/mL。将该初步纯化的组分MCP进一步通过Sephadex G-10凝胶层析分离,以超纯水为洗脱液洗脱,得到三个组分MCP-1、MCP-2和MCP-3,分别测其在对ACE抑制的IC5o为0.739 mg/mL、0.298mg/mL和0.163 mg/mL,反复进样,选择活性最高的峰MCP-3收集。对MCP-3进行活性稳定性实验,结果显示,MCP-3对温度、酸碱变化以及消化酶均有不同程度的耐受性,随着温度或酸碱条件的变化,其对ACE的抑制活性均有良好的稳定性,体外模拟消化实验也表明MCP-3经胃肠道酶系消化后仍会保持较稳定的ACE抑制活性。此外,通过考察不同抑制剂浓度下,底物浓度变化与反应速率的关系,研究得出MCP-3对ACE的抑制类型为竞争性抑制。 对MCP-3利用半制备型RP-HPLC进行进一步的分离纯化,得到5个主要的洗脱峰,分别进行活性测定,选择ACE活性抑制率最高的洗脱峰MCP-3-4进行收集,并利用分析型RP-HPLC对其进行纯度鉴定,结果显示,该组分在220 nm和280 nm的洗脱谱图中,只出现了一个单一的尖峰,说明MCP-3-4是个单一的肽段。通过液质联用进行序列分析,得到MCP-3-4为相对分子质量294.2的二肽,其一级序列结构为Glu-Phe。
【学位授予单位】:浙江工商大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ464.7

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【参考文献】
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