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《浙江工商大学》 2018年
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群体感应AHLs信号分子对鱼源杀鲑气单胞菌致腐及抗胁迫能力的影响

刘丽  
【摘要】:群体感应(quorum sensing,QS)参与调控食源性微生物的致病性和致腐性。气单胞菌为气单胞菌属(Aeramonas)的革兰氏阴性直杆菌,是水产养殖业重要的条件致病菌和生鲜鱼类贮藏中的腐败菌。前期研究已从腐败大黄鱼中分离出致腐性强的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida),发现A.salmonicida能够诱导群体感应生物报告菌产生颜色,提示该细菌具有N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHLs)活性。然而,鱼源致腐菌salmonicida产生的AHLs与致腐内在调控作用研究仍较少。鉴于此,本论文以A.salmonicida AE03为研究对象,分析在不同培养条件下AHLs的形成规律和种类;扩增并分析编码AHLs的基因asaI,构建asaI基因突变株;比较研究野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在生长、腐败表型、运动性、生物被膜形成和抗胁迫性的影响。进一步采用qRT-PCR技术探究asaI缺失对致腐和抗胁迫性相关基因表达的影响。研究旨在揭示AHLs介导的QS对A.salmonicid 致腐和抗胁迫能力的调控作用,为食品腐败菌机理和控制研究提供理论支持。主要结果如下:利用生物报菌紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026检测了A.salmonicid AE03不同培养条件下AHLs的形成规律。结果发现4℃和28℃下培养的AE03均能使CV026产生紫色反应,其中在4℃培养5d和28℃培养30h的上清诱导产生的紫色圈最大,呈现密度依赖性。随着培养基中氯化钠浓度增高,AE03产生的AHLs活性逐步增强,其中1.5%氯化钠紫色圈最大,之后紫色圈减少。采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测培养上清中AHLs种类和含量,显示 AE03 能够产生 C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL五种信号分子,其中C4-HSL含量最高,并且28℃培养30 h达到最高,与报告菌结果一致。AE03上清在弱酸或强碱处理下AHLs活性明显下降,其中pH 7.8时AHLs活性保持最高。高温加热能降解菌体上清中AHLs信号分子,随着加热时间的延长,CV026变色圈直径迅速减少,AHLs活性逐渐丧失。采用PCR在A.salmonicida AE03中扩增出asaI基因,通过融合PCR和自杀性质粒,构建A.salmonicida AE03 asaI基因突变株。AHLs活性检测显示,突变株asaI丧失诱导报告菌CV026产生紫色,HPLC-MS/MS也发现AHLs含量很低,未检测到C4-HSL和C6-HSL信号分子。比较研究野生株、asaI突变株及C4-HSL回补株在体外培养和鱼汁中的腐败表型、生物被膜、抗胁迫性和致腐能力的差异。研究显示,AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在28℃下生长无显著差异。相比于野生株,asaI突变株在12 h、18 h和24 h后三甲胺(TMA)分别增加100.2%、22.3%和24.9%,而添加C4-HSL回补株TMA有所下降,特别是添加40μMC4-HSL时TMA分别下降52.7%、28.5%和27%。相似地,asaI突变株在培养12 h、18 h、24 h形成的生物胺比野生株分别增加 21.5%、22.4%和 23.2%(p0.05),而 20 μM C4-HSL回补株分别下降 16.3%、7.2%和 6.5%(p0.05),40 μM C4-HSL 处理组则减少28.6%,14.5%和16.4%(p0.05)。突变株胞外蛋白酶的活性也显著提高(p0.05),外源添加4-HSL导致突变株分泌胞外蛋白酶活性下降,与野生株的蛋白酶活性接近。可见与野生株相比,asaI突变株腐败表型都显著增强,并且外源C4-HSL添加浓度越高,致腐产物形成降低,表现浓度依赖性。结晶紫染色法发现A.salmonicida AE03生物被膜形成速度较快,其中培养12 h被膜产量达到最大值,而asaI突变株比野生株的被膜量减少32.1%,共聚焦显微镜观察也显示AE03成熟的生物被膜厚度为52.52 μm,而asaI突变株仅为36.66 μm。野生株和突变株的抗胁迫性比较研究发现,在50℃热处理后菌体的存活率逐渐减少,其中60 min后野生株和突变株存活率分别下降为46.8%和54.1%(p0.05);2 mM双氧水处理导致野生株存活率急剧下降,而asaI突变株减少较为缓慢,经5 min处理后两菌株的存活率分别为70.3%和87.1%(p0.05);30%氯化钠处理90 min时,野生株和突变株存活率分别为50.5%和59.8%(p0.05)。结果发现,asaaI突变株能够增强菌体对高温、双氧水和高盐的抗胁迫能力。因此,A.salmonicida AE03中asaI基因突变促进TMA和生物胺的形成,增加胞外蛋白酶活性和泳动性,而减弱生物被膜形成;外源C4-HSL添加能部分恢复致腐表型,表现浓度依赖性;asaI基因突变还能增强对环境抗胁迫性。进一步评价AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在4℃冷藏灭菌鱼汁中致腐能力的变化。结果显示,AE03野生株、asaI突变株和C4-HSL回补株在鱼汁样品中生长无显著差异,在4℃第3 d达到早期稳定期。AE03在冷藏最初2d蛋白酶活性、TMA和挥发性盐基氮(TVB-N)增长缓慢,而第3d其含量迅速增长,第5 d达到最高值。AE03 野生株、asaaI 突变株、20μM C4-HSL 和 40μM C4-HSL回补株第5 d时的蛋白酶活性分别为5.92、8.16、6.64和5.88活力单位;TMA 含量分别为 22.81、33.18、30.19 和 26.70 mg/100mL;TVB-N含量分别为 22.75、27.30、24.85 和 22.62 mgN/mL。相对于 AE03 野生株,asaI突变株在冷藏鱼汁中的蛋白酶活性、TMA和TVB-N含量明显增强,而突变株中添加C4-HSL减少腐败能力。结果表明,asaI基因突变促进AE03在冷藏鱼汁腐败酶和代谢产物的产生,加速腐败进程。而外源添加C4-HSL降低了 asaI突变株腐败能力,进一步提示asaI基因及AHLs参与调控AE03的致腐能力。为探究asaI基因对AE03致腐酶、鞭毛和抗性基因表达的影响,采用qRT-PCR检测氧化三甲胺还原酶(TMAO reductase)基因torA、编码赖氨酸脱羧酶基因cadA、鞭毛相关基因fliR、过氧化氢酶基因katG和AHLs感受蛋白基因asaR在不同生长阶段的转录水平。结果发现,野生株、突变株和C4-HSL回补组之间在对数生长期(12 h)、稳定初期(18h)和稳定期(24h)三个阶段5个基因的相对表达量都存在显著差异。突变株的tord、cadA、fliR和katG在18 h时的表达量与野生株差异最大,分别增加了 2.29、2.29、1.69和9.86倍。而突变株asaR基因相对表达量在12 h与野生株差异最大,为野生株的2.65倍。突变株在培养24 h五个基因的表达量都逐渐下降,仅torA和katG基因表达量大于野生株(P0.01)。同时,asaI突变株中20 μM和40 μM C4-HSL的回补株,5个基因的相对表达量都显著下降,并逐渐恢复至野生株水平,尤其是40μMC4-HSL添加组。可见,A.salmonicida在4℃和28℃都能分泌AHLs信号分子,该分子参与调控A.salmonicida致腐和抗胁迫作用,其中C4-HSL正调控该菌的生物被膜形成,而负调控致腐和抗胁迫相关基因表达,进而影响致腐及抗胁迫能力。
【学位授予单位】:浙江工商大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.3

【参考文献】
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