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《中国计量学院》 2013年
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酶促水解大豆分离蛋白制备铁螯合肽的研究

张墨楠  
【摘要】:铁是构成血红素所必不可少的主要成分,它是人体必须的微量元素之一,参与体内多种生物化学代谢作用。无机铁在食物中虽然含量比较高,但是吸收利用率非常低,难以被人体充分利用。生物肽铁,如多肽铁的吸收率远远高于无机铁,它在治疗缺铁性疾病特别是缺铁性贫血方面疗效显著,逐渐受到人们重视。我国拥有丰富的大豆资源,且随着蛋白水解技术日渐成熟,以大豆蛋白为原料,酶解制备金属螯合肽的研究受到原来越多的关注。制备金属螯合肽提高矿物质元素吸收率的同时也为人体提供了优质氮源。本文以去除植酸的大豆分离蛋白为原料,采用可控酶解技术,以蛋白含量、水解度、亚铁螯合能力为指标,通过对大豆分离蛋白的原料预处理、化学修饰、酶的筛选、水解条件的优化等制备铁螯合肽,并测定其氨基酸组成、分子量范围,评价其亚铁螯合能力,通过逐级超滤、亲和层析色谱、反相高效液相色谱及电喷雾离子化质谱法对其进行分离纯化与结构鉴定。主要研究结果如下: (1)选择717#阴离子交换树脂对大豆分离蛋白进行脱植酸处理,植酸脱除率达80%以上。 (2)以亚铁螯合能力为指标,确定经磷酸化修饰的大豆分离蛋白水解肽活性最高,且酶解后磷酸化修饰多肽活性优于酶解前磷酸化修饰多肽。对酶解后大豆分离蛋白水解肽进行磷酸化修饰的条件优化如下:三偏磷酸钠添加量为2.0%,pH9,温度30℃,时间30min。在此条件下反应,多肽亚铁螯合能力为18.45mg EDTA/g-protein。 (3)以低植酸的大豆分离蛋白为底物,比较碱性蛋白酶,胰蛋白酶,中性蛋白酶,风味蛋白酶,胃蛋白酶和复合蛋白酶六种蛋白酶对大豆分离蛋白水解肽水解度和亚铁螯合能力的影响。结果表明,使用胰蛋白酶时,水解度大、亚铁螯合率高。 (4)对胰蛋白酶水解条件进行单因素优化实验。以亚铁螯合率为指标的最佳水解条件为:底物浓度40mg/mL,酶浓度1000U/L,pH8.0,温度37℃,时间120min,此时水解度为21.8%,亚铁螯合能力为2.85mg EDTA/g-protein。 (5)铁肽复合物制备工艺进行单因素优化实验。以铁螯合率和大豆分离蛋白水解肽-铁复合物得率为指标,优化条件为:pH5、多肽与铁盐比例3:1、多肽浓度40mg/mL、温度25℃、时间20min。大豆分离蛋白水解肽-铁复合物与大豆蛋白水解肽相比,氨基酸组成、营养价值并无太大改变,仍可作为氨基酸的补充来源,并且可以作为良好的铁补充剂。通过大豆分离蛋白水解肽-铁复合物性质检测与成分分析,表明制备所得物质是不同于大豆蛋白水解肽和氯化亚铁的新物质—大豆分离蛋白水解肽-铁复合物。 (6)对磷酸化修饰的大豆分离蛋白水解液进行超滤分离,分成四个分子量肽段,其中分子量3kDa的肽段亚铁螯合活性最高,达到131.29mgEDTA/g-protein。 (7)采用亲和层析分离得到I1、I2两个组分,亚铁螯合活性测定后取活性较高的I2,用制备型YMC-Protein柱进行分离,得到I2F1、 I2F2、 I2F3、 I2F4和I2F5五个峰,其中I2F5具有较高的亚铁螯合活性。 (8)目标肽的亚铁螯合能力为805.64mg EDTA/g-protein,经电喷雾离子化质谱法测定其分子量为563.3Da,氨基酸序列为Met-Pro-Val-Asn-Cys。
【学位授予单位】:中国计量学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TQ914.1

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【参考文献】
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