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蚜虫病原真菌块状耳霉的生物学特性研究及其休眠机制探索

王丹琪  
【摘要】:块状耳霉是一种极具应用潜力的重要蚜虫生防真菌,它可以通过体壁接触感染并杀死害虫,而且能够引发流行病控制害虫的种群数量。本论文以分离自非洲大陆的块状耳霉Ct10201菌株为研究对象,进行与休眠孢子应用相关的基础研究。 首先,利用基于Photoshop软件的快速有效测定菌落生长速率的方法,对该菌株的基本生物学特性进行研究。块状耳霉Ct10201的最适的生长温度范围为25-30℃。在培养基pH值为5-11的7个处理条件中,块状耳霉Ct10201菌株的最适pH值范围为7-8。光照条件在光暗交替(12L:12D)下块状耳霉菌落生长速度最快。另外,通过对该菌株的培养基营养因素进行筛选研究后发现,果糖和麦芽糖对Ct10201菌株的生长促进作用明显,而木糖对该菌株的生长有明显的抑制作用。Ct10201菌株在丙氨酸,亮氨酸和无氮条件下都生长良好。该菌在维生素需求方面没有特殊要求。 其次,在对块状耳霉Ct10201菌株进行液体培养时意外发现,在培养2天后再转接培养2天会产生大量的相对均一的短菌丝,长度为134.6±65.7μm(n=50)。将长度相对均一的短菌丝平铺到培养皿中,可以在的25℃避光条件下,短时间内能够形成大量休眠孢子。采用响应面设计方法对分离条件进行优化,得到最优条件为乳化剂浓度1.68%、超声功率20w、超声时间45.80s,孢子量获得的最大值为72.40×10~4个/ml。将分离所得休眠孢子进行进一步分离纯化,发现滤膜过滤法是蔗糖密度梯度法,饱和硫酸锌漂浮法和滤膜过滤法三种分离方法中较优的一种。另外,我们还对分离纯化得到的休眠孢子进行萌发观察,用上述方法获得的休眠孢子萌发率在80%以上。 最后,为了探索休眠孢子的可能休眠机制,将上述方法获得的纯净休眠孢子和通过“孢子浴”获得的分生孢子两者胞内的可溶性蛋白和SOD、POD,CAT和PPO等酶的酶活进行比较后发现,两者蛋白质含量和SOD活性相差较大,单个分生孢子的可溶性蛋白含量为23.63±0.67×10~(-8)mg,是休眠孢子的十倍。同样,分生孢子内的SOD总活性也远大于休眠孢子,另外,分生孢子和休眠孢子的POD,CAT和PPO含量均未检出。我们对可溶性蛋白进行SDS-PAGE的结果显示,分生孢子和休眠孢子存在多条特异性条带差异明显,经软件分析后显示,分生孢子可溶性蛋白在41KDa,36KDa,29KDa,19KDa,15KDa左右处有特异性条带,休眠孢子可溶性蛋白在56KDa,32KDa,16KDa左右处有特异性条带。实验结果证明了分生孢子和休眠孢子可溶性蛋白中所含蛋白质种类和数量差异明显。


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