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《安徽大学》 2017年
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pH超敏感聚原酸酯药物载体的设计、制备及抗肿瘤活性研究

闫国卿  
【摘要】:对于临床上大多数癌症的治疗,化学疗法是不可替代的治疗策略。但化疗药物由于肿瘤选择性差,导致在临床上抗肿瘤效果不显著,同时也会对正常组织或器官产生毒副作用。近些年来聚合物纳米药物传递系统的发展为解决这些问题提供了新的解决途径,目前经美国FDA批准上市的纳米药物如PEG化的阿霉素脂质体(Doxil/Caelyx)、道诺霉素脂质体(DaunoXome)等在临床上显著地降低了化疗药物的毒副作用,在整体上提升了病人的存活率。但是其在肿瘤部位的药物富集能力仍需进一步提高。因此,迫切需要研发一种新型的纳米药物传递系统以提高化疗药物在肿瘤部位的靶向富集能力,从而获得更好的抗肿瘤效果。由于肿瘤组织特殊的理化特性,从血管到肿瘤细胞存在明显的pH梯度(血管:~7.4;肿瘤组织胞外酸环境:~6.5-7.2;内涵体:~5.0-6.0;溶酶体:-4.0-5.0),因此,可以通过精确设计pH敏感的纳米药物载体来提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的靶向性。目前大多数的pH响应的纳米药物载体主要针对肿瘤细胞内的微酸环境(pH~4.0-6.0),但是这些酸敏感药物载体依然无法精确区分肿瘤胞外微酸环境(pH~6.5-7.2)和正常生理环境(PH~7.4),从而导致相对低效的肿瘤靶向性以及不可避免的在正常组织出现药物分布,也会导致在肿瘤细胞内酸刺激响应性弱、释药缓慢的问题。因此,有必要开发出pH超敏感的纳米药物载体,使之能够在血管中稳定存在并精确响应肿瘤组织微酸环境,进而增强抗肿瘤药物的靶向性和灭杀能力。与乙缩醛、缩酮、腙键等酸敏感键相比,原酸酯键在微酸条件下的水解速率可以提高1-4个数量级。原酸酯的水解速率极其依赖于其周围的亲疏水环境,已有大量的文献报道,当聚合物分子链中的原酸酯处于较亲水性基团环境中,在pH=5时候,其完全水解仅需要几小时;当原酸酯处于较疏水性基团环境中,在在pH=5时候,其完全水解需要数天时间。本课题组在前期的研究中,已经制备了大量的基于原酸酯的pH敏感纳米药物载体,均表现出良好的生物相容性和微酸响应性,其中一些纳米粒子在微酸条件下表现出明显的粒径变化,鉴于肿瘤组织的的高渗透性和滞留性(EPR效应),可以利用这些粒径变化特性实现药物在肿瘤组织的靶向富集。基于以上研究背景,通过精确调控不同功能基团(聚乙二醇、乳糖酸、氟化物)或主链链长优化原酸酯周围亲疏水环境,设计、制备了一系列基于主链聚原酸酯的pH超敏感纳米药物载体,以提高纳米药物载体在肿瘤部位的靶向富集能力。主要研究内容如下:(1)通过缩聚以及酿胺反应成功合成侧链接枝聚乙二醇单甲醚(MPEG)(Mn=550,1000,2000 Da)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-MPEG550,POEAd-g-MPEG1000,POEAd-g-MPEG2000),利用核磁共振(NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)、三硝基苯磺酸法(TNBS)等对共聚物化学结构进行表征;以POEAd-g-MPEG为基础制备了空白胶束以及载阿霉素(DOX)胶束,利用动态光散射仪(DLS)、透射电镜(TEM)、荧光分光光度计等对胶束进行表征。空白胶束在不同pH条件下随时间变化的原酸酯降解、粒径变化以及释药行为分别通过1NMR、DLS以及酶标仪跟踪测定,实验结果表明:POEAd-g-MPEG胶束在肿瘤组织微酸条件下具有pH超敏感性,并且具有粒径动态变化行为:(i)在pH =7.4的条件下能够稳定存在;(ii)在pH=6.5的条件下粒径先变小后变大;(iii)在pH=5.5的条件下胶束溶解,快速释药。采用MTT法检测空白胶束对人骨髓神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)和人胚胎肾细胞系(293T)的细胞毒性以及载药胶束对SH-SY5Y的细胞毒性。结果显示空白胶束无细胞毒性,载药胶束与DOX细胞毒性相似。分别利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对三种载药胶束的细胞摄取能力进行定性和定量评估,结果表明载药胶束的细胞摄取能力与胶束粒径以及PEG化程度密切相关。通过建立体外3D肿瘤模型(SH-SY5Y MCs),分别利用激光共聚焦显微镜和倒置显微镜对载药胶束的肿瘤渗透以及抑瘤能力进行评价;实验结果显示,与DOX比较,载药胶束在12小时内成功渗透到3D多细胞球体内部,并且在3天内使组成3D多细胞球体的肿瘤细胞全部被杀死,这是目前文献报道的体外抗肿瘤活性最好的纳米药物载体。(2)通过缩聚以及接枝反应成功合成侧链接枝乳糖酸(LA)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-LA20,POEAd-g-LA50,POEAd-g-LA80),利用核磁共振(NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)、三硝基苯磺酸法(TNBS)等对共聚物化学结构进行表征;以聚合物POEAd-g-LA为基础制备了空白胶束以及载阿霉素(DOX)胶束(POEAd-g-LA20-DOX,POEAd-g-LA50-DOX,POEAd-g-LA80-DOX),利用动态光散射仪(DLS)、透射电镜(TEM)、荧光分光光度计等对胶束进行表征。空白胶束在不同pH条件下随时间变化的原酸酯降解、粒径变化以及释药行为分别通过1NMR、DLS以及酶标仪跟踪测定,实验结果表明:POEAd-g-LA胶束在肿瘤组织微酸条件下具有pH超敏感性,并且具有粒径动态变化行为:(i)在pH=7.4的条件下能够稳定存在;(ii)在pH=6.5的条件下粒径逐渐变大;(iii)在pH=5.5的条件下胶束快速变大,释放药物。采用MTT法检测空白胶束对人肝癌细胞系(HepG2)和人胚胎肾细胞系(293T)的细胞毒性以及载药胶束对SH-SY5Y、HepG2、鼠肝癌细胞系(H22)的细胞毒性,结果显示空白胶束无细胞毒性;与阿霉素比较,载药胶束对肝癌细胞系的毒性较高或与之近似,但是对SH-SY5Y的毒性低于裸药组。分别利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对三种载药胶束的细胞摄取能力进行定性和定量评估,结果表明载药胶束的细胞摄取能力在肝癌细胞系中与DOX相似,但是在SH-SY5Y中低于DOX。结果暗示胶束表面的乳糖酸能够显著提高胶束在肝癌细胞中的摄取能力。通过建立小鼠体内H22肝癌肿瘤模型,以DOX为对照组测定载药胶束在体内各个组织的药物分布情况以及抑瘤能力;实验结果显示,POEAd-g-LA20-DOX具有更强的肿瘤富集以及抑制肿瘤生长的能力,同时也证明了其能够显著降低对心脏的毒副作用。(3)为了提高化疗效率,具有不同氟化程度的聚原酸酯共聚物通过温和的缩聚反应成功制备,利用核磁共振(NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)等对共聚物化学结构进行表征;以共聚物为基础利用乳液蒸发法制备空白纳米微球(POEAd-C3、POEAd-g-F3、POEAd-g-F5)以及载阿霉素纳米微球(POEAd-C3-DOX、POEAd-g-F3-DOX、POEAd-g-F5-DOX),利用动态光散射仪(DLS)、透射电镜(TEM)等对纳米微球性状进行表征。空白纳米微球在不同pH条件下随时间变化的原酸酯降解、粒径变化以及释药行为分别通过1NMR、DLS以及酶标仪跟踪测定,实验结果表明:纳米微球对肿瘤胞内外酸环境具有pH超敏感性并且逐步取得了在在pH =7.4的条件下能够稳定存在,在pH=6.5条件下粒径发生动态变化,在pH=5.5的条件下快速溶解或溶胀,完全释放药物。采用MTT法检测空白纳米微球对HepG2和293T的细胞毒性以及载药纳米微球对SH-SY5Y、HepG2、H22的细胞毒性,结果显示空白纳米微球无细胞毒性;POEAd-g-F-DOX对肿瘤细胞系的毒性近似于或高于DOX。分别利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对载药纳米微球的细胞摄取能力进行定性和定量评估,结果表明POEAd-g-F-DOX的细胞摄取能力近似于或高于DOX。结果暗示氟化的纳米微球能够显著增强其在肿瘤细胞中的摄取能力。通过建立体外3D肿瘤模型(SH-SY5Y MCs),分别利用激光共聚焦显微镜和倒置显微镜对载药胶束的肿瘤渗透以及抑瘤能力进行评价;实验结果显示,POEAd-g-F-DOX在12小时内完全占据整个MCs,并且在5天内使组成3D多细胞球体的肿瘤细胞全部被杀死。通过建立小鼠体内H22肝癌肿瘤模型,以DOX为对照组测定载药胶束在体内各个组织的药物分布情况以及抑瘤能力;实验结果表明,POEAd-g-F-DOX具有更强的肿瘤部位药物富集能力、抑制肿瘤生长能力同时降低了药物对正常组织的毒副作用。(4)为了比较纳米药物传递系统在肿瘤细胞胞内外不同的释药策略对抗肿瘤效果的影响,通过温和的缩聚反应成功制备了具有不同链长的聚原酸酯共聚物,利用核磁共振(NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)等对共聚物化学结构进行表征;以共聚物为基础利用乳液蒸发法制备空白纳米微球(POEAd-C3、POEAd-C6)以及载阿霉素纳米微球(POEAd-C3-DOX、POEAd-C6-DOX),利用动态光散射仪(DLS)、透射电镜(TEM)等对纳米微球性状进行表征。空白纳米微球在不同pH条件下随时间变化的原酸酯降解、粒径变化以及释药行为分别通过1NMR、DLS以及酶标仪跟踪测定,实验结果表明:POEAd-C3-DOX在pH=5.5和pH=6.5的条件下具有pH超敏感性,都表现出快速溶液、释放药物的行为;而POEAd-C6-DOX只表现出在pH=5.5条件下的刺激响应、快速释放药物的行为。体外MTT以及细胞摄取实验表明在pH =6.5条件下POEAd-C3-DOX更易被肿瘤细胞摄取并且表现出比POEAd-C6-DOX更强的细胞毒性,但是体外SH-SY5Y MCs实验证明POEAd-C6-DOX具有更强的肿瘤渗透和抑瘤能力,并且小鼠体内H22肝癌肿瘤模型实验同样证明POEAd-C6-DOX具有更强的在肿瘤组织药物富集、抑瘤能力以及降低对正常组织毒副作用的能力。因此,从释药策略而言,POEAd-C6-DOX的胞内释药策略表现出更强的整体性抗肿瘤效果。
【关键词】:原酸酯 pH超敏感 聚乙二醇 乳糖酸 氟化作用 抗肿瘤 药物传递
【学位授予单位】:安徽大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R943;R96
【目录】:
  • 摘要3-7
  • Abstract7-17
  • 第一章 绪论17-43
  • 1.1. 抗肿瘤研究现状17
  • 1.2. 纳米药物传递系统17-28
  • 1.2.1. EPR效应概述18
  • 1.2.2. EPR效应的局限性18-19
  • 1.2.3. 主动靶向19
  • 1.2.4. 主动靶向的局限性19-20
  • 1.2.5. 肿瘤部位结合位点障碍20-21
  • 1.2.6. 克服结合位点障碍的方法21-28
  • 1.3. 本论文的主要内容和创新28-32
  • 参考文献32-43
  • 第二章 侧链接枝PEG的pH超敏感聚原酸酯胶束的设计、制备及性能研究43-70
  • 2.1. 引言43-45
  • 2.2. 实验部分45-51
  • 2.2.1. 材料和方法45
  • 2.2.2. 2,2,2-三氟-N-(1,3-丙二醇)乙酰胺(NF)的合成45-46
  • 2.2.3. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二丁二酸丙二酯(NFC)的合成46
  • 2.2.4. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二-(4,-N'琥珀酰亚胺丁二酸)丙二酯(BOD)的合成46-47
  • 2.2.5. 侧链接枝三氟乙酰基主链聚原酸酯POEAd-g-F_3的合成47
  • 2.2.6. 侧链接枝氨基主链聚原酸酯POEAd-g-NH_2的合成47
  • 2.2.7. 侧链接枝聚乙二醇单甲醚主链聚原酸酯POEAd-g-MPEG的合成47-48
  • 2.2.8. POEAd-g-MPEG胶束制备48
  • 2.2.9. 临界胶束浓度(CMC)的确定48
  • 2.2.10. 胶束主链原酸酯水解速率的确定48-49
  • 2.2.11. 载药胶束POEAd-g-MPEG-DOX的制备49
  • 2.2.12. 载药量(DLC)和包埋率(DLE)测定49
  • 2.2.13. 胶束粒径的测定49
  • 2.2.14. 体外药物释放测定49-50
  • 2.2.15. 体外细胞毒性实验50
  • 2.2.16. 载药胶束在SH-SY5Y中摄取情况测定50
  • 2.2.17. SH-5Y5Y 3D多细胞球体(MCs)的制备50-51
  • 2.2.18. 在SH-SY5Y MCs中肿瘤渗透情况51
  • 2.2.19. SH-SY5Y MCs抑制生长研究51
  • 2.3. 结果与讨论51-65
  • 2.3.1. POEAd-g-MPEG共聚物的合成及表征51-57
  • 2.3.2. POEAd-g-MPEG胶束的pH超敏感性57-60
  • 2.3.3. 基于pH超敏感的粒径动态变化60-61
  • 2.3.4. 依赖于pH超敏感的体外药物释放61-62
  • 2.3.5. 载药胶束的体外细胞毒性和细胞摄取62-63
  • 2.3.6. SH-SY5YMCs肿瘤渗透63-64
  • 2.3.7. 抑制MCs研究64-65
  • 2.4. 结论65-66
  • 参考文献66-70
  • 第三章 侧链接枝乳糖酸的pH超敏感聚原酸酯胶束的设计、制备及性能研究70-97
  • 3.1. 引言70-72
  • 3.2. 实验部分72-78
  • 3.2.1. 材料和方法72
  • 3.2.2. 2,2,2-三氟-N-(1,3-丙二醇)乙酰胺(NF)的合成72
  • 3.2.3. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二丁二酸丙二酯(NFC)的合成(NFC)的合成72-73
  • 3.2.4. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二-(4'-N'-琥珀酰亚胺丁二酸)丙二酯(BOD)的合成73
  • 3.2.5. 侧链接枝三氟乙酰基主链聚原酸酯POEAd-g-F3的合成73-74
  • 3.2.6. 侧链接枝氨基主链聚原酸酯POEAd-g-NH_2的合成74
  • 3.2.7. 侧链接枝乳糖酸聚原酸酯POEAd-g-LA的合成74
  • 3.2.8. POEAd-g-LA胶束制备74-75
  • 3.2.9. 临界胶束浓度(CMC)的确定75
  • 3.2.10. 胶束主链原酸酯水解速率的确定75
  • 3.2.11. 载药胶束POEAd-g-LA-DOX的制备75-76
  • 3.2.12. 载药量(DLC)和包埋率(DLE)测定76
  • 3.2.13. 胶束粒径的测定76
  • 3.2.14. 体外药物释放测定76
  • 3.2.15. 体外细胞毒性实验76-77
  • 3.2.16. 载药胶束细胞摄取测定77
  • 3.2.17. 体内药物分布实验77
  • 3.2.18. 体内抗肿瘤活性77-78
  • 3.2.19. 数据分析78
  • 3.3. 结果与讨论78-93
  • 3.3.1 接枝共聚物的合成与表征78-84
  • 3.3.2. POEAd-g-LA胶束的pH超敏感性84-88
  • 3.3.3. 依赖于pH超敏感的粒径变化88
  • 3.3.4. 药物释放88-89
  • 3.3.5. 体外细胞毒性和细胞摄取89-90
  • 3.3.6. 体内药代动力学和药物分布90-91
  • 3.3.7. 体内抑瘤实验91-93
  • 3.4. 结论93-94
  • 参考文献94-97
  • 第四章 氟化的pH超敏感聚原酸酯纳米微球的设计、制备及性能研究97-128
  • 4.1. 引言97-99
  • 4.2. 实验部分99-105
  • 4.2.1. 实验材料99
  • 4.2.2. 2,2,2-三氟-N-(1,3-丙二醇)乙酰胺(NF)的合成99
  • 4.2.3. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二丁二酸丙二酯(NFC)的合成99-100
  • 4.2.4. 2-N-三氟乙酰基-1,3-二-(4'-N'-琥珀酰亚胺丁二酸)丙二酯(BOD)的合成100
  • 4.2.5. 侧链接枝三氟乙酰基主链聚原酸酯POEAd-g-F3的合成100-101
  • 4.2.6. 侧链接枝全氟酰胺主链聚原酸酯POEAd-g-F5的合成101
  • 4.2.7. 主链聚原酸酯POEAd-C3的合成101
  • 4.2.8. 空白和载药纳米微球的制备101-102
  • 4.2.9. 纳米微球主链原酸酯水解速率的确定102
  • 4.2.10. 载药量(DLC)和包埋率(DLE)测定102
  • 4.2.11. 纳米微球粒径的测定102
  • 4.2.12. 体外药物释放测定102-103
  • 4.2.13. 体外细胞毒性实验103
  • 4.2.14. 载药纳米微球细胞摄取测定103
  • 4.2.15. SH-Y5Y 3D多细胞球体(MCs)的制备103-104
  • 4.2.16. 在SH-SY5Y MCs中肿瘤渗透情况104
  • 4.2.17. 对SH-SY5Y MCs抑制生长研究104
  • 4.2.18. 体内药物分布实验104
  • 4.2.19. 体内抗肿瘤活性104-105
  • 4.2.20. 数据分析105
  • 4.3. 结果与讨论105-122
  • 4.3.1. 共聚物和纳米微球系统的合成与表征105-112
  • 4.3.2. 纳米微球的pH超敏感性112-115
  • 4.3.3. 依赖于pH超敏感的粒径动态变化115
  • 4.3.4. 基于pH超敏感的药物释放115-116
  • 4.3.5. 载药纳米微球的体外细胞毒性以及细胞摄取116-117
  • 4.3.6. MCs中肿瘤渗透117-119
  • 4.3.7. MCs抑瘤实验119
  • 4.3.8. 体内药物分布119-120
  • 4.3.9. 体内抗肿瘤活性120-122
  • 4.4. 结论122-124
  • 参考文献124-128
  • 第五章 基于聚原酸酯酰胺纳米微球探索肿瘤胞内外释药方式对化疗疗效的影响128-155
  • 5.1. 引言128-129
  • 5.2. 实验部分129-135
  • 5.2.1. 实验材料129-130
  • 5.2.2. 1,3-二丁二酸丙二酯的合成(BC_3)的合成130
  • 5.2.3. 1,3-二-(4'-N'-琥珀酰亚胺丁二酸)丙二酯(BC_3D)的合成130
  • 5.2.4. 1,6-二-(6'-N'-琥珀酰亚胺丁二酸)己二酯(BC_6D)的合成130-131
  • 5.2.5. 主链聚原酸酯POEAd-C3的合成131
  • 5.2.6. 主链聚原酸酯POEAd-C6的合成131-132
  • 5.2.7. 空白和载药纳米微球的制备132
  • 5.2.8. 纳米微球主链原酸酯水解速率的确定132
  • 5.2.9. 载药量(DLC)和包埋率(DLE)测定132
  • 5.2.10. 纳米微球粒径的测定132-133
  • 5.2.11. 体外药物释放测定133
  • 5.2.12. 体外细胞毒性实验133
  • 5.2.13. 载药纳米微球细胞摄取测定133-134
  • 5.2.14. SH-Y5Y 3D多细胞球体(MCs)的制备134
  • 5.2.15. 在SH-SY5Y MCs中肿瘤渗透情况134
  • 5.2.16. 对SH-SY5Y MCs抑制生长研究134
  • 5.2.17. 体内药物分布实验134-135
  • 5.2.18. 体内抗肿瘤活性135
  • 5.2.19. 数据分析135
  • 5.3. 结果与讨论135-149
  • 5.3.1.合成和表征135-140
  • 5.3.2. pH敏感性140-143
  • 5.3.3. 依赖pH敏感的粒径变化143
  • 5.3.4. 药物释放143
  • 5.3.5. 细胞毒性和细胞摄取143-145
  • 5.3.6. MCs中肿瘤渗透145-147
  • 5.3.7. MCs抑瘤实验147
  • 5.3.8. 体内药物分布147-148
  • 5.3.9. 体内抗肿瘤活性148-149
  • 5.4. 结论149-151
  • 参考文献151-155
  • 第六章 总结及展望155-158
  • 6.1. 本论文的主要结论及意义155-156
  • 6.2. 展望156-158
  • 毕业有感158-159
  • 已发表学术成果159

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