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《安徽大学》 2017年
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黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种三种新型糖苷酶的鉴定及性质研究

刘洋  
【摘要】:嗜热微生物是一种生活在高温环境中的微生物,在探讨生物进化、高温适应机制和嗜热酶资源的挖掘方面都具有重要的意义。随着基因组测序技术的进步,很多嗜热微生物的全基因组被测序,这为挖掘新型酶资源提供了很好的资源。黄热厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus favithermussubsp.yunnaensis)E13T最适生长温度为55℃,2014年其基因组测序完成。本课题对该菌株的糖苷酶进行了分析,筛选出三个未被报道且与已知同源性酶相似性较低(不超过60%)的糖苷水解酶进行克隆表达和酶学研究。这三个酶为β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21,BglP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC.3.2.1.23,BgalP)和 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22,AgalP)。β-葡萄糖苷酶BglP克隆在表达载体pET22b上,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,纯化后的蛋白分子量为52kDa,与理论分子量一致。酶学性质结果显示,BglP的最适温度为60Κ,最适pH为7.0。BglP的热稳定性很好,60℃的半衰期长达10 h。它在中性和弱碱环境(pH 7.0-8.5)中也非常稳定。BglP在以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物时的比活为 842±15.5U/mg,Km为0.29±0.0mM,Vmax为771±39μmol/min.mg。以纤维二糖为底物时,BglP的Km和Vmax分别为12.3±0.8mM和107±5.6μmol/min.mg,这表明BglP是一个催化效率很高的酶。值得注意的是,BglP是一个比较少见的葡萄糖和木糖激活酶。当葡萄糖和木糖的浓度分别高于2.2 M和1.4 M时,BglP的活力才出现抑制效应,而在这个浓度以内,BglP的活力被显著的提高,最高时分别为无添加时的2.6倍(葡萄糖激活)和1.8倍(木糖激活)。葡萄糖不仅能提高BglP的酶活,还能显著提高BglP的温度稳定性。这些性质综合表明BglP是一个具有优良潜力的新型β-葡萄糖苷酶。BglP在最优条件下对大豆苷水解率为98.5%,对染料木苷水解率为96.8%,展示出其在大豆异黄酮产业中的良好应用潜力。BglP在纤维素降解方面也具有明显的应用优势,以Celluclast 1.5L降解甘蔗渣为例,BglP可以提高转化率1.9倍。当反应体系中存在高浓度葡萄糖(500mM)或木糖(200mM)时,BglP可以分别提高3.4和3.0倍的转化率。β-半乳糖苷酶BgalP克隆在表达载体PET32a上,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,纯化后的蛋白分子量为76 kDa,与理论分子量一致。酶学性质结果显示BgalP反应的最适温度为55℃,最适pH为6.5。BgalP的热稳定性很好,65℃的半衰期为8h。在以oNPG为底物时,比酶活为188 U/mg,优于同家族中其他细菌来源的β-半乳糖苷酶。此外,BgalP对常见的有机溶剂具有很好的耐受能力,而目前的研究中,对于耐有机溶剂性质的β-半乳糖苷酶鲜见报道,因此该β-半乳糖苷酶可以应用在含有机溶剂环境下的工业催化领域。αα-半乳糖苷酶AgalP克隆在表达载体pET32a上,纯化后的蛋白分子量为86 kDa,但是是包涵体。采用镍柱复性法对AgalP包涵体蛋白进行了复性,复性率为25%。酶学性质结果显示,AgalP的最适反应温度为65℃,热稳定性好,65℃下的半衰期达到5.5 h。最适反应pH为7.0,在pH 5-10的范围可保持较好的酸碱稳定性。在以pNPGal为底物时,比酶活为22 U/mg,Km值为0.143 mM,Vmax为5.2μmol/min.mg。与同类酶比较后,结果显示该酶的活性水平较低。
【学位授予单位】:安徽大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;Q936

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