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《安徽大学》 2017年
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黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种三种新型糖苷酶的鉴定及性质研究

刘洋  
【摘要】:嗜热微生物是一种生活在高温环境中的微生物,在探讨生物进化、高温适应机制和嗜热酶资源的挖掘方面都具有重要的意义。随着基因组测序技术的进步,很多嗜热微生物的全基因组被测序,这为挖掘新型酶资源提供了很好的资源。黄热厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus favithermussubsp.yunnaensis)E13T最适生长温度为55℃,2014年其基因组测序完成。本课题对该菌株的糖苷酶进行了分析,筛选出三个未被报道且与已知同源性酶相似性较低(不超过60%)的糖苷水解酶进行克隆表达和酶学研究。这三个酶为β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21,BglP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC.3.2.1.23,BgalP)和 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC3.2.1.22,AgalP)。β-葡萄糖苷酶BglP克隆在表达载体pET22b上,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,纯化后的蛋白分子量为52kDa,与理论分子量一致。酶学性质结果显示,BglP的最适温度为60Κ,最适pH为7.0。BglP的热稳定性很好,60℃的半衰期长达10 h。它在中性和弱碱环境(pH 7.0-8.5)中也非常稳定。BglP在以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物时的比活为 842±15.5U/mg,Km为0.29±0.0mM,Vmax为771±39μmol/min.mg。以纤维二糖为底物时,BglP的Km和Vmax分别为12.3±0.8mM和107±5.6μmol/min.mg,这表明BglP是一个催化效率很高的酶。值得注意的是,BglP是一个比较少见的葡萄糖和木糖激活酶。当葡萄糖和木糖的浓度分别高于2.2 M和1.4 M时,BglP的活力才出现抑制效应,而在这个浓度以内,BglP的活力被显著的提高,最高时分别为无添加时的2.6倍(葡萄糖激活)和1.8倍(木糖激活)。葡萄糖不仅能提高BglP的酶活,还能显著提高BglP的温度稳定性。这些性质综合表明BglP是一个具有优良潜力的新型β-葡萄糖苷酶。BglP在最优条件下对大豆苷水解率为98.5%,对染料木苷水解率为96.8%,展示出其在大豆异黄酮产业中的良好应用潜力。BglP在纤维素降解方面也具有明显的应用优势,以Celluclast 1.5L降解甘蔗渣为例,BglP可以提高转化率1.9倍。当反应体系中存在高浓度葡萄糖(500mM)或木糖(200mM)时,BglP可以分别提高3.4和3.0倍的转化率。β-半乳糖苷酶BgalP克隆在表达载体PET32a上,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,纯化后的蛋白分子量为76 kDa,与理论分子量一致。酶学性质结果显示BgalP反应的最适温度为55℃,最适pH为6.5。BgalP的热稳定性很好,65℃的半衰期为8h。在以oNPG为底物时,比酶活为188 U/mg,优于同家族中其他细菌来源的β-半乳糖苷酶。此外,BgalP对常见的有机溶剂具有很好的耐受能力,而目前的研究中,对于耐有机溶剂性质的β-半乳糖苷酶鲜见报道,因此该β-半乳糖苷酶可以应用在含有机溶剂环境下的工业催化领域。αα-半乳糖苷酶AgalP克隆在表达载体pET32a上,纯化后的蛋白分子量为86 kDa,但是是包涵体。采用镍柱复性法对AgalP包涵体蛋白进行了复性,复性率为25%。酶学性质结果显示,AgalP的最适反应温度为65℃,热稳定性好,65℃下的半衰期达到5.5 h。最适反应pH为7.0,在pH 5-10的范围可保持较好的酸碱稳定性。在以pNPGal为底物时,比酶活为22 U/mg,Km值为0.143 mM,Vmax为5.2μmol/min.mg。与同类酶比较后,结果显示该酶的活性水平较低。
【关键词】:β-葡萄糖苷酶 β-半乳糖苷酶 α-半乳糖苷酶 葡萄糖木糖激活
【学位授予单位】:安徽大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;Q936
【目录】:
  • 摘要3-5
  • Abstract5-12
  • 第一章 绪论12-27
  • 1.1 嗜热微生物和嗜热酶12-14
  • 1.1.1 极端微生物及嗜热微生物12
  • 1.1.2 黄热厌氧芽孢杆菌12-13
  • 1.1.3 嗜热酶13-14
  • 1.2 糖苷水解酶14-15
  • 1.2.1 糖苷水解酶定义14
  • 1.2.2 糖苷水解酶的分类14
  • 1.2.3 糖苷水解酶的命名14
  • 1.2.4 糖苷水解酶家族14-15
  • 1.3 β-葡萄糖苷酶15-20
  • 1.3.1 β-葡萄糖苷酶简介15
  • 1.3.2 β-葡萄糖苷酶的来源15
  • 1.3.3 β-葡萄糖苷酶的分类15-16
  • 1.3.4 β-葡萄糖苷酶的结构16-17
  • 1.3.5 β-葡萄糖苷酶的催化机制17
  • 1.3.6 β-葡萄糖苷酶的相对分子质量17
  • 1.3.7 β-葡萄糖苷酶的底物特异性17
  • 1.3.8 β-葡萄糖苷酶的最适pH和pH稳定性17-18
  • 1.3.9 β-葡萄糖苷酶的最适温度及温度稳定性18
  • 1.3.10 β-葡萄糖苷酶动力学参数18
  • 1.3.11 β-葡萄糖苷酶的获得18
  • 1.3.12 β-葡萄糖苷酶的应用18-20
  • 1.4 大豆异黄酮20-21
  • 1.4.1 大豆异黄酮简介20
  • 1.4.2 大豆异黄酮的应用20
  • 1.4.3 酶法制备大豆异黄酮苷元20-21
  • 1.5 β-半乳糖苷酶21-22
  • 1.5.1 β-半乳糖苷酶概述及来源21
  • 1.5.2 耐热β-半乳糖苷酶家族分类21
  • 1.5.3 β-半乳糖苷酶的催化性质21-22
  • 1.5.4 β-半乳糖苷酶的生物学特性22
  • 1.5.5 β-半乳糖苷酶的应用22
  • 1.6 α-半乳糖苷酶22-23
  • 1.6.1 α-半乳糖苷酶简介22-23
  • 1.6.2 α-半乳糖苷酶的来源23
  • 1.6.3 α-半乳糖苷酶的分类和特性23
  • 1.6.4 α-半乳糖苷酶的应用23
  • 1.7 包涵体复性23-25
  • 1.7.1 包涵体简介23-24
  • 1.7.2 包涵体复性的步骤24
  • 1.7.3 影响包涵体复性的因素24-25
  • 1.8 有机溶剂耐受酶25
  • 1.9 本研究的目的意义及主要研究内容25-27
  • 1.9.1 研究目的25-26
  • 1.9.2 研究意义26
  • 1.9.3 研究内容26-27
  • 第二章 β-葡萄糖苷酶BgIP的重组表达和酶学性质研究27-49
  • 2.1 实验材料27-30
  • 2.1.1 菌株与质粒27
  • 2.1.2 主要试剂27
  • 2.1.3 主要仪器27-28
  • 2.1.4 培养基及溶剂配置28-30
  • 2.2 实验方法30-34
  • 2.2.1 家族分类和保守序列分析30
  • 2.2.2 黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种的培养和基因组提取30-31
  • 2.2.3 pET22b-bglp重组质粒的构建31
  • 2.2.4 重组蛋白BglP的表达和纯化31
  • 2.2.5 β-葡萄糖苷酶酶活测定31-32
  • 2.2.6 最适反应温度和温度稳定性测定32
  • 2.2.7 最适pH和pH稳定性测定32
  • 2.2.8 动力学参数测定32-33
  • 2.2.9 金属离子和化学试剂对BglP酶活力的影响33
  • 2.2.10 BglP的底物特异性测定33
  • 2.2.11 各类糖对BglP酶活力的影响33
  • 2.2.12 高浓度葡萄糖和木糖对BglP酶活力的影响33-34
  • 2.2.13 葡萄糖对BglP温度稳定性的影响34
  • 2.3 结果与讨论34-48
  • 2.3.1 BglP的氨基酸序列分析34-36
  • 2.3.2 重组质粒pET22b-bglp的构建36-37
  • 2.3.3 BglP的诱导表达和纯化37
  • 2.3.4 BglP的最适反应温度和温度稳定性37-39
  • 2.3.5 BglP的最适pH和pH稳定性39-40
  • 2.3.6 BglP的底物特异性和比活40-42
  • 2.3.7 BglP的酶动力学42-43
  • 2.3.8 金属离子和化学试剂对BglP酶活的影响43-44
  • 2.3.9 寡糖对BglP酶活力的影响44-46
  • 2.3.10 葡萄糖对BglP温度稳定性的影响46-48
  • 本章小结48-49
  • 第三章 β-葡萄糖苷酶BglP在制备大豆异黄酮苷元和提高甘蔗渣转化率方面的应用研究49-57
  • 3.1 实验材料49
  • 3.2 实验方法49-51
  • 3.2.1 大豆异黄酮有效成分的提取49
  • 3.2.2 色谱条件49
  • 3.2.3 BglP水解大豆异黄酮能力的初步确定49-50
  • 3.2.4 大豆异黄酮酶解条件的优化50
  • 3.2.5 甘蔗渣的制备50-51
  • 3.2.6 BglP对甘蔗渣转化率的影响51
  • 3.3 结果与讨论51-56
  • 3.3.1 BglP酶解大豆异黄酮能力的确定51-52
  • 3.3.2 BglP酶解大豆异黄酮最优条件的确定52-54
  • 3.3.3 BglP对甘蔗渣在高浓度葡萄糖和木糖下转化率的影响54-56
  • 本章小结56-57
  • 第四章 β-半乳糖苷酶BgalP的重组表达及酶学性质研究57-70
  • 4.1 实验材料57
  • 4.2 实验方法57-58
  • 4.2.1 pET32a-bgalp重组质粒的构建57
  • 4.2.2 序列分析和家族分类57
  • 4.2.3 重组蛋白BgalP的表达和纯化57
  • 4.2.4 β-半乳糖苷酶的酶活测定57-58
  • 4.3 结果与讨论58-68
  • 4.3.1 BgalP的氨基酸序列分析58-60
  • 4.3.2 重组质粒pET32a-bgalp的构建60-61
  • 4.3.3 BgalP的诱导表达和纯化61-62
  • 4.3.4 BgalP的最适反应温度62
  • 4.3.5 BgalP的温度稳定性62-63
  • 4.3.6 BgalP最适反应pH63-64
  • 4.3.7 BgalP的pH稳定性64-65
  • 4.3.8 金属离子对BgalP酶活力的影响65-66
  • 4.3.9 BgalP的催化效率66-67
  • 4.3.10 有机溶剂对BgalP酶活的影响67-68
  • 本章小结68-70
  • 第五章 α-半乳糖苷酶AgalP的重组表达、包涵体复性及初步酶学性质研究70-81
  • 5.1 实验材料70
  • 5.1.1 菌种与质粒、主要试剂、主要仪器70
  • 5.1.2 溶液70
  • 5.2 实验方法70-72
  • 5.2.1 重组质粒pET32a-agalp的构建70-71
  • 5.2.2 序列分析和AgalP的诱导表达71
  • 5.2.3 AaalP蛋白可溶性表达条件的摸索71
  • 5.2.4 AgalP包涵体蛋白的收集71
  • 5.2.5 AgalP包涵体的洗涤与变性71
  • 5.2.6 AaalP包涵体镍柱复性和纯化71-72
  • 5.2.7 AgalP标准酶活性测定72
  • 5.3 结果与讨论72-79
  • 5.3.1 AgalP的氨基酸序列分析72-74
  • 5.3.2 pET32-agalp重组质粒的构建74
  • 5.3.3 AgalP的诱导表达74-75
  • 5.3.4 AgalP可溶性表达条件的摸索75
  • 5.3.5 AgalP包涵体镍柱复性和纯化75-76
  • 5.3.6 AgalP最适反应温度和温度稳定性76-77
  • 5.3.7 AgalP的最适反应pH和pH稳定性77-78
  • 5.3.8 AgalP的动力学参数78-79
  • 5.3.9 金属离子和化学试剂对AgalP酶活的影响79
  • 本章小结79-81
  • 第六章 结论和展望81-83
  • 6.1 结论81-82
  • 6.2 特色与创新点82
  • 6.3 展望82-83
  • 参考文献83-97
  • 附录97-100
  • 致谢100-101
  • 研究生期间发表论文情况101

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