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《安徽大学》 2017年
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线粒体靶向/荧光多功能纳米平台和胶束的制备及其生物医用研究

张晔  
【摘要】:恶性肿瘤,即癌症,是21世纪威胁人类健康和生命的最严重疾病之一。迄今癌症治疗尚未取得重大突破,其原因主要有三:化疗药物的高毒副作用、肿瘤的转移和患者的耐药性。传统的治疗癌症的方法主要有手术、化疗和放疗等,其中化疗是癌症综合治疗时的常用手段。但是化疗的疗效一直不佳,原因在于化疗药物通常由注射给药进入人体血液,药物在到达肿瘤组织之前经过蛋白结合、代谢、排泄等诸多过程之后,血药浓度很快下降,最终到达肿瘤病灶部位的药物非常有限;欲提高肿瘤组织中的化疗药物的浓度就必须加大用药剂量,但这同时也会增大化疗药物对正常组织器官的毒副作用。此外,化疗药物大多缺乏专一性,患者在用药期间容易产生多药耐药性(MDR),导致癌症治疗的难度加大。针对上述问题,"靶向治疗"的概念应运而生,靶向治疗的核心目的是增加治疗部位的药物浓度、减少药物的毒副作用,提高药物的安全性和治疗效率。线粒体是细胞内最重要的细胞器之一,不但含有遗传物质(线粒体DNA),而且供给真核细胞代谢所需能量,此外,线粒体应激氧化或受损还可能激活和调控细胞凋亡通路。因此,线粒体被认为是治疗癌症及其他线粒体相关疾病最有效的靶点之一。纳米材料和纳米科技的飞速发展为癌症的靶向治疗提供了新材料和新手段。在本文中,我们合成了带线粒体靶向基团的多功能纳米粒子,并且将具有优良生物相容性的荧光碳量子点与之相结合,构建并制备了集线粒体靶向和显影示踪等多功能为一体的纳米平台;此外,利用纳米自组装与生物共轭技术,将抗癌药物负载到具有线粒体靶向/荧光多功能的纳米胶束上,用于逆转肿瘤的MDR。论文的主要研究内容及研究结果如下:1.以天然产物大蒜为碳源,通过热解、乙醇提取、超纯水纯化等过程得到氮、硫元素共掺杂的碳量子点(g-CQDs)。通过研究发现:(1)g-CQDs的含氮量为6.46%,含硫量为0.34%,粒径为5.28 nm,其内核具有类石墨化的晶格结构;(2)以硫酸喹啉为参比,g-CQDs在水中的荧光量子产率达到13.76%;(3)g-CQDs在乙醇和水中的荧光发射光谱具有激发光波长依赖性;(4)g-CQDs具有良好的pH稳定性,在pH 2-12的范围内g-CQDs水分散液的荧光强度基本没有变化;(5)g-CQDs的荧光发射还表现出溶剂依赖性,在介电常数较高的溶剂中表现出更强的荧光强度;(6)g-CQDs对Fe3+具有高度选择性,浓度为0.5 mM的Fe3+水溶液能够使g-CQDs的荧光猝灭至10%以下。我们选取人乳腺癌细胞(MCF-7)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为模型,采用MTT法检测g-CQDs的细胞毒性,结果表明:当g-CQDs的浓度达到400μg/mL时细胞存活率仍在80%以上。然后,我们在MCF-7和SH-SY5Y的二维(2D)平面细胞和三维(3D)多细胞球体(MCs)中观察了 g-CQDs的显影效果,激光共聚焦显微镜(CLSM)测试结果表明,在405 nm的光激发下,g-CQDs在2D和3D细胞模型中均发出明亮的蓝色荧光,呈现较好的细胞成像效果。2.以水热法制备的超顺磁性四氧化三铁纳米晶为核,通过stober法包覆介孔二氧化硅壳层,然后在壳层表面修饰具有线粒体靶向功能的三苯基膦分子(TPP),再进一步与魔芋粉热解得到的氮掺杂的碳量子点(N-CDs)发生共轭,构建一个集线粒体靶向性、长时荧光显影功能及磁响应性的多功能纳米平台(Fe3O4@mSi02-TPP/CDs)。通过透射电子显微镜、综合物性测量系统、紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪等表征手段,发现该纳米平台呈均一的核-壳结构,平均粒径约为43 nm,室温下呈现为超顺磁性且具有和N-CDs相似的荧光性能。我们通过热失重曲线分析,发现修饰到Fe3O4@mSiO2上的靶向分子TPP以及N-CDs分别占材料质量百分比为12.18%和1.76%。此外,Fe3O4@mSiO2-TPP纳米粒子带正电(其Zeta电位值为+33.47mV),N-CDs在水溶液中带负电(其Zeta电位值为-21.66mV),当前者与后者共轭之后Zeta电位值下降至+16.33 mV,但激光动态光散射(DLS)检测结果显示粒子的流体力学半径却随之增大,证明我们成功地构建了线粒体靶向/荧光多功能纳米平台Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs。3.选取人肺腺癌细胞(A549)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人宫颈癌细胞(HeLa)、SH-SY5Y、原代人包皮成纤维细胞(HFF)和人微血管内皮细胞(HMEC-1)为模型,对Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs纳米平台进行细胞毒性检测,结果表明该纳米平台没有明显的细胞毒性,也基本不会引起细胞凋亡。将Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs分别与上述6种细胞共培养24h后,在不同波长的激光通道下分别呈现出稳定、明亮的蓝色、绿色和红色荧光,表明该纳米平台具有多色长时显影的功能。通过激光共聚焦显微镜(CLSM)、流式细胞仪和细胞切片的透射电镜检测手段表明:与不具有靶向性的Fe3O4@mSi02纳米粒子相比,Fe3O4@mSiO2-TPP能够更好地与线粒体染料Mitotracker Red共定位于细胞线粒体。我们还利用CLSM的Z轴扫描技术排除了纳米颗粒是粘附在细胞表面发出荧光的可能,证明Fe3O4@mSi02-TPP确实进入了 HFF细胞,富集在线粒体部位。此外,我们还研究了外加静态小磁场(0.3 T)对细胞摄取该纳米平台的影响,结果表明当共培养时间在1小时之内时,外加磁场对细胞内吞Fe3O4@mSi02-TPP纳米粒子有明显的增强作用。4.利用DCC/DMAP偶联技术在一种非离子表面活性剂D-αα-维生素E聚乙二醇玻珀酸酯(TPGS)末端修饰上线粒体靶向基团TPP,然后将TPGS-TPP和HDA包覆的碳量子点(CQDs)自组装形成纳米胶束CQDs-TPGS-TPP。通过TEM和DLS等表征手段,发现CQDs-TPGS-TPP自组装后可以形成单层直径约100 nm的纳米胶束,也可以形成直径更大的嵌套囊泡。我们将CQDs-TPGS-TPP纳米胶束分别与MCF-7细胞和耐药型MCF-7/ADR细胞共培养24小时后,采用MTT法检测细胞存活率,结果表明该纳米胶束的细胞毒性很小。进一步研究表明该纳米胶束不仅具有线粒体靶向性,而且因组装了荧光CQDs可直接用于细胞成像。此外,构成该胶束的主要成分TPGS自身能够抑制P-gp蛋白的表达、减少细胞胞浆内药物的泵出,是一种MDR逆转试剂。因此,我们用CQDs-TPGS-TPP纳米胶束负载抗肿瘤药物阿霉素(DOX),由体外载药和释药实验结果得知,该纳米胶束对DOX的负载率可达到3.4%,而且载药纳米胶束可以在弱酸性环境下缓慢释放所载的DOX。将载药纳米胶束CQDs-TPGS-TPP/DOX与MCF-7/ADR细胞一起共培养,发现与等当量浓度的游离DOX原药相比,载药纳米胶束对MCF-7/ADR细胞具有更强的杀伤力。进而,采用MCF-7和MCF-7/ADR的3D MCs进行渗透实验,结果表明:与游离的DOX原药相比,CQDs-TPGS-TPP能够帮助运送更多的DOX进入MCs内部,达到较为理想的渗透效果。而且,在MCF-7/ADR MCs中,与等当量的游离DOX原药相比,载药纳米胶束CQDs-TPGS-TPP/DOX能够更有效地杀伤MCF-7/ADR细胞,抑制MCF-7/ADR MCs的生长。上述结果表明CQDs-TPGS-TPP纳米胶束在一定程度上能够逆转耐药细胞和耐药肿瘤组织的多药耐药性。
【学位授予单位】:安徽大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ460.1

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