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CTB-mST2融合蛋白在大肠杆菌表达及其生物活性鉴定

赵聪  
【摘要】: 肠产毒性大肠杆菌(Escherichia Escherichia coli,ETEC)是引起人类和家畜腹泻的主要病原菌。热稳定肠毒素基因(ST)是其一种毒力单位,介导致病。霍乱弧菌(Vibrio Cholera)是引起霍乱流行的病原菌,曾在世界范围引起多次大的流行,死亡率很高。霍乱B亚单位无毒性,但能与大多数哺乳动物细胞膜上的神经结苷脂GM1结合,含有大部分毒素抗原的决定簇,有很强的抗原性,在霍乱的抗毒免疫中起重要作用。 本文利用PCR技术分别从保存的基因质粒中克隆出霍乱毒素B亚单位(CTB)和重组热稳定肠毒素基因(mST)。利用重叠PCR技术,通过Linker将CTB基因和串连的mST连接,得到CTB-mST2的融合基因。将所得到的基因分别插入表达载体pET-22b(+)和PITG-Trx,构成表达载体pET-CTB-mST2,pET-Trx1/ctb-st2和pET-Trx2/ctb-st2。将质粒转化相应的宿主菌BL21(DE3)获得克隆,经IPTG诱导获得CTB-mST2融合蛋白。经超声破菌和SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白的表达后均以包涵体的形式存在。为了得到目的蛋白的高表达量,采用多因素正交优选法优化了培养基及培养条件。多因素正交优选法考察了4个因素和3个水平,培养条件从起始诱导菌密度,诱导温度,IPTG浓度和诱导时间进行考察。最后经摇瓶培养,在优化培养基及培养条件下融合蛋白表达量可达320mg/L,占总蛋白40%。对表达产物进行包涵体复性后,经过亲合层析纯化得到融合蛋白,纯化的融合蛋白CTB-mST2经薄层凝胶扫描分析纯度大于95%。对该融合蛋白抗原性和免疫原性进行了分析,Western Blotting表明CTB-mST2能与CTB抗体发生免疫反应。融合蛋白免疫小鼠,可获得高滴度抗CTB和ST血清;将融合蛋白与灭活的O157:H7菌体组合免疫小鼠,可产生对O157:H7毒株攻击的保护力,而且呈现出相对于灭活O157:H7菌体单独免疫更强的保护力。比本项研究为构建抗ETEC和EHEC复合疫苗提供依据。


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