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《中国科学技术大学》 2011年
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相容性溶质结合蛋白OpuCC和粘蛋白结合蛋白Spr1345结构功能研究

杜洋  
【摘要】:(I)相容性溶质结合蛋白OpuCC的结构生物学研究 相容性溶质(compatible solute)的ABC(ATP-binding cassette)转运系统对于细胞抵御环境突然或者骤变的渗透压是非常关键的。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进化出一套复杂的级联渗透压调节机制,其中有三个ABC转运系统(OpuA,OpuB和OpuC)在渗透压力胁迫时负责获取多种类别的相容性溶质分子。每个ABC转运系统包含三种组分,以OpuC系统为例:底物结合蛋白OpuCC,负责转运底物的特异性;跨膜通道OpuCB/OpuCD,负责转运底物从葆外到胞内;ATPase部分OpuCA,负责利用水解ATP的能量驱动底物转运。其中,34-kDa的脂蛋白OpuCC是迄今发现的转运底物特异性最为广泛的底物结合蛋白,特别是在枯草芽孢杆菌是作为肉毒碱(carnitine)、氢嘧啶(ectoine)和胆碱-O-硫酸(choline-O-sulfate)等唯一的转运系统。在本研究中,我们同时使用荧光光谱测定法测定了OpuCC和70%同源性的OpuBC(只对胆碱有底物特异性)的底物特异性。为了深入探讨OpuCC多底物结合特性的机制,我们解析了分别结合四种底物的晶体结构,包括结合肉毒碱、甘氨酸甜菜碱、胆碱和氢嘧啶的形式。同时,我们也解析了结合不结合任何底物的结构,这就使得我们可以了解OpuCC结合底物之后的别构效应。这些结合不同底物的结构具体的底物结合位点的作用网络是各不相同的,这就可以帮助解释为什么OpuCC的底物特异性如何广泛。我们通过序列分析,发现OpuCC序列上的一个点突变导致其相比于胆碱特异的同源蛋白OpuBC进化出这种多底物结合的特性。此外,我们还发现了OpuCC的一个新的功能角色,就是粘蛋白结合蛋白(mucin-binding protein),很可能作为粘附分子参与枯草芽孢杆菌对于宿主消化道的组织粘附。我们的研究将会有利于理解相容性溶质结合蛋白的底物特异性和功能发挥的结构生物学机制。 (II)粘蛋白结合蛋白Spr1345的结构生物学研究 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是危害人类健康的主要致病菌之一。它的表面蛋白(surface protein)作为毒力因子(virulence factor)在此菌的致病机制中发挥了关键的作用。表面蛋白主要分为三类:胆碱结合蛋白、脂蛋白和含有LPxTG基序的蛋白。来自R6菌株的22-kDa的Spr1345即是C末端含有LPxTG的表面蛋白,它是肺炎链球菌中鉴定明确的很少的粘附分子之一,参与肺和呼吸道上皮细胞表面粘蛋白的粘附和定植,并且也是迄今鉴定的最小的粘蛋白结合蛋白。它包含一个粘蛋白结合结构域(mucin-binding domain,MucBD)、脯氨酸富集的结构域(proline-rich domain,PRD)和含有LPxTG基序的C末端区域。分选酶sortaseA会在LPxTG的Thr和Gly之间进行切割,并把成熟的蛋白(含有171个残基,命名为MF171)转移并共价连接到细胞壁的肽聚糖上。细胞免疫荧光实验进一步证明粘蛋白结合结构域可以粘附在人肺细胞系A549的细胞膜表面,这暗示了粘蛋白结合结构域确实是Spr1345参与宿主粘附的功能单位。同时,我们利用结合实验也发现粘蛋白结合结构域与成熟蛋白相比,具有相当的粘蛋白结合能力,由于粘蛋白结合结构域在纯化过程中比较稳定,因而我们解析了此结构域2.0 (A|。)的晶体结构,它代表了第一个结构解析的病原菌的粘蛋白结合结构域。整体结构展现出了一个典型的免疫球蛋白样的延展型β三明治拓扑结构,同时也是解析的最小的具有粘蛋白结合活性功能单位的结构。在结构中的一些β片层上的保守疏水氨基酸,特别是一个长loop区域的一些残基,使得这个结构域形成一个疏水性的致密内核。因为有功能试验暗示了此结构域和粘蛋白和结合可能是由和粘蛋白表面的糖链介导的,于是我们使用了InCa-SiteFinder服务器预测了粘蛋白结合结构域表面的可能的糖结合位点,大部分都位于C末端区域,这和结构分析证明C端区域结构比较保守是趋于一致的。既然Spr1345是一个已经明确鉴定的肺炎链球菌表面的粘附分子,我们的研究将为开发针对肺炎链球菌疾病的疫苗或者药物提供结构生物学上的有益启示。 (III)高铁作用下的酿酒酵母转录组应答机制研究 铁作为一种微量元素广泛存在于自然界,其利用和稳态的保持对于细胞的生长和分裂都发挥着关键的角色。它参与很多重要的基础代谢中,比如细胞呼吸、铁硫簇合成和含铁酶的酶活等。酿酒酵母的铁代谢和转运机制已经得到了充分的阐明,主要通过转录因子Aft1/2的激活启动一系列铁代谢相关基因的表达,并且涉及低亲和力铁转运蛋白Fet4和高亲和力铁转运蛋白Fet3的铁转运。然而这些研究都集中在铁离子浓度低于1 mM的代谢和调控研究,对于高于1 mM铁(铁过剩条件,iron-surplus condition)的生物学效应却不清楚。在我们的研究中,我们使用基因芯片技术分别分析了酿酒酵母在过量铁1小时和4小时的作用下,其细胞在转录组水平上的代谢机制。经过对基因表达谱的分析,我们揭示出高铁对于酵母的双重生物学效应。一系列压力应答的基因经过一般压力转录因子Msn4的激活出现上调,这暗示了高铁作为重金属胁迫效应的一面。同时,在高铁下涉及有氧呼吸和和合成代谢的一些基因也出现了上调,这些基因的激活促进了酵母细胞的生长速度。这种高铁的双重效应暗示了过量的铁相比其它重金属来说,参与了一个更为复杂的调控网络,而不仅仅是之前认为的只作为一种重金属的压力胁迫。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q51

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