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《中国科学技术大学》 2011年
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詹氏甲烷球菌NifH1和酿酒酵母Ndl1的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析

吴昊  
【摘要】:1固氮作用是由固氮菌中的固氮复合物完成的。固氮复合物由固氮酶和固氮还原酶组成,其中固氮酶是一个由NifD和NifK蛋白组成的α2β2异四聚体,固氮还原酶是一个由NifH蛋白组成的同二聚体。目前,已经在没有固氮作用的嗜热产烷生物詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)中发现了固氮酶NifD/K和NifH同源物的表达(命名为NflD/K和NlfH,Nfl=Nif-like,M. jannaschii中的NlfH在这里被称作Mj.NifH1),但是其功能还不清楚。解出Mj.NifH1的晶体结构将对我们理解其功能以及了解其在进化上的作用提供很大的帮助。 在本课题中,我们构建了Mj.NifH1的表达载体,并通过镍柱亲和和HiLoad 16/60 Superdex 200 size-exclusion column凝胶层析等方法得到了纯化后的目的蛋白。目的蛋白通过悬滴气相扩散法在287K进行晶体生长,并得到可以进行X射线衍射和数据收集的蛋白晶体。在上海同步辐射加速器收集到一套最高分辨率为3.3 ?的衍射数据。晶体的空间群是P4132,晶胞参数为a = b = c =139.45 ?,确定每个不对称单位含有一个蛋白分子。 2动力蛋白(Dynein)是一种细胞中的马达蛋白,可以将包含ATP在内的化学能转换为运动过程中的机械能,在有丝分裂、膜转运和胞内运输中起着关键作用。动力蛋白作用的发挥需要许多蛋白的共同协调作用,如NUDEL家族中的一员Ndl1,对于动力蛋白正常地定位到动粒上非常关键。Ndl1可以激活动力蛋白调节的蛋白转运,而当它结合到分裂激素和动力蛋白时,可以稳定动力蛋白或动力蛋白激活蛋白,使其不会进行微管依赖的脱落过程,从而进一步产生分子马达的作用。Ndl1缺失时会导致结合到微管正极的动力蛋白减少,从而影响有丝分裂等过程。 在本课题中,为获得酿酒酵母中Ndl1蛋白(Sc.Ndl1)的晶体结构,为进一步了解其发挥功能的分子机制提供线索,我们构建了Sc.Ndl1的表达载体,并表达、纯化得到目的蛋白,并进行晶体生长。目前得到一颗Sc.Ndl1蛋白晶体,晶体优化正在进行中。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TS261.1

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【参考文献】
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