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《中国科学技术大学》 2012年
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大肠杆菌RNA分子伴侶Hfq的结构以及与RNA相互作用的研究

王维维  
【摘要】:Hfq是细菌里重要的转录后调节因子。它能够帮助非编码sRNA与目标mRNA的配对。Hfq蛋白对于DsrA介导的rpoS mRNA在低温下的翻译激活是必须的。rpoS编码的稳态sigma因子σS是大肠杆菌中一般应激响应的核心控制因子。大肠杆菌内的Hfq蛋白是一个102个残基(11.2kDa)的Sm家族RNA分子伴侣蛋白。N端的1~65号残基(Hfq65)组成保守的Sm结构域而C端的部分(66~102号残基)则是一个没有固定结构但是却在功能上十分重要的部分。Sm结构域形成同六聚体圆盘状结构,Hfq65六聚体分子量约43kDa,Hfq全长六聚体分子量约67kDa。圆盘的两个面分别构成能与U-rich单链RNA序列结合的近端和能与A-rich单链RNA序列结合的远端。然而,Hfq蛋白与DsrA相互作用的结构信息还未知。尽管有报道称Hfq有水解ATP的能力,但是ATP结合位点和ATP水解的生物学意义都不清楚。没有严整结构的HfqCTD的折叠属性和发挥功能的机制也是一个未解之谜。我们对Hfq65和HfqCTD进行了核磁共振(NMR)谱的主链归属,并且获得了Hfq65和Hfq全长(HfqFL)蛋白异亮氨酸,亮氨酸和颉氨酸侧链甲基的选择性标记样品的甲基HMQC谱。我们发现,Hfq65和HfqFL的1H-15NHSQC以及~1H-~(13)C甲基HMQC都有显著的不同。HfqCTD和Hfq65的相互NMR滴定实验表明这两者之间没有显著的相互作用。我们用Gd(DPA)3作为顺磁标签,在PRE实验中获得了初步的结果显示在HfqFL中,HfqCTD可能与Hfq65之间有瞬时的相互作用。我们还获得了大肠杆菌Hfq与DsrA上面的主要Hfq识别区域AU_6A以及ADP的三元复合物晶体结构,以及Hfq与ADP的二元复合物晶体结构。AU_6A结合到一个Hfq的近端和另一个Hfq的远端。ADP结合到远端的嘌呤选择性结合位点并且有一些ADP用磷酸基团与另一个Hfq上近端的保守精氨酸或是谷氨酰胺侧链相互作用。这样的ADP结合模式与之前人们推测的不同。我们在ATP酶活实验中验证了这些与ADP磷酸基团接触的保守的极性残基对于ATP酶活性的重要性。我们发现ATP酶活性会降低Hfq与U-rich序列的结合亲和力。在RNA浓度远高于Hfq浓度的情况下,ATP的存在可以增强Hfq的分子伴侣活性。我们用Hfq和DsrA的片段在溶液核磁共振以及荧光偏振实验中获得的结果验证了多个Hfq六聚体在与DsrA结合时的合作现象。用Hfq全长和DsrA全长进行的荧光共振能量转移实验也支持Hfq全长在与DsrA全长相互作用时需要多个六聚体的相互合作。我们基于以上的结果,提出一个Hfq通过多个六聚体之间的合作来完成其功能的猜想。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q93

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