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《中国科学技术大学》 2011年
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蛋白质内含子溶液结构和性质及药物靶点作用

郑玉船  
【摘要】:本论文涉及蛋白质内含子(Intein)的蛋白质结构、溶液性质以及intein作为药物靶点的研究工作,研究内容主要分为三个部分:1)结核分支杆菌RecA mini-intein的溶液结构和动力学。研究发现,尽管关键氨基酸残基的突变影响了蛋白质的剪接活性,但是氨基酸突变对蛋白质的结构影响不大,这一结果与晶体结构研究的结论相似。蛋白质溶液性质的核磁共振研究表明V67L突变使RecA mini-intein的结构更加稳定,D121G突变明显影响由D121侧链构建的氢键网,从而影响RecA intein的蛋白质剪接与C端的断裂活性。2)集胞藻PCC6803DnaE split intein的N端剪接域的溶液性质以及N端与C端剪接域的相互作用。研究发现N端剪接域在溶液中表现出典型的内在无序蛋白质性质,尽管仍有少量的二级结构存在。NMR实验结果表明C端剪接域加入后明显促进了N端剪接域的折叠,同时体内共表达实验亦表明C端与N端剪接域之间的共折叠,随后利用SPR测定两者间的相互作用。3) intein潜在的抗结核药物靶点作用与金属化合物抑制intein剪接。研究结果表明抑制intein剪接可以有效的阻止结核菌的生长,铂配合物要比其它金属化合物表现出更好的抑制效果,获得了结构/活性之间的关系,在所有实验的化合物中顺铂表现出最好的抑制效果。 第一章是对intein即蛋白质内含子的综述,主要涉及intein与蛋白质剪接的概念、intein的分布与基因迁移、intein的保守基序、intein的类型、intein的剪接机理、intein的三维结构及intein的应用。内容包括本论文涉及的顺式剪接和反式剪接,即由连续、完整的基因序列所编码的顺式intein诱导的剪接过程和两个分裂的基因序列所编码的反式intein诱导的剪接过程。 第二章是关于结核分支杆菌RecA mini-intein的溶液结构和动力学研究。我们通过稳定同位素标记方法获得了15N和/或13C-标记的RecA mini-intein,随后利用核磁共振方法解析V67L突变体(splicing mutant, SM)和D121G/V67L突变体(cleavage mutant, CM)的溶液结构及这两个蛋白质与CM139_V67的溶液动力学性质。通过溶液结构与晶体结构比较发现主链构象没有明显差异,属于典型的HINT折叠结构。通过氢氘交换实验发现V67L突变增强RecA intein整体结构的稳定性,而蛋白质结构没有明显变化。D121G突变抑制了N端的断裂活性,但促进了C端的断裂活性,利用氢氘交换、组合化学位移干扰研究表明D121G突变破坏了由D121侧链构建的氢键网,因此降低了蛋白质剪接效率,同时由于C端失去氢键的约束,所以D121G突变造成C端的断裂活性增强。 第三章是关于集胞藻PCC6803DnaE split intein的溶液性质及N端(123aa)与C端(36aa)剪接域的相互作用研究。反式蛋白质剪接与顺式蛋白质剪接的不同在于前者需要intein的剪接域即N端与C端相互结合以后才能发生蛋白质剪接,因此N端与C端剪接域的分子识别与结合过程必然影响到反式intein的剪接能力与剪接效率。我们通过基因重组分别得到DnaE-N123、DnaE-C36、共表达DnaE-N123-C36复合蛋白质,在生理条件下DnaE-N123的圆二色谱数据表明N端剪接域趋向无结构,但残留有部分二级结构,这些二级结构随着变性剂(尿素和盐酸胍)的加入而逐渐失去。蛋白质的变温实验、凝胶过滤色谱与动态光散射实验证实N端剪接域的内在无序性。生物信息学方法分析N端剪接域的序列显示它处于无序和有序蛋白的分界范围,当将C端剪接域的序列加入后就移动到有序蛋白质区域,这一预测得到了实验的证实。核磁共振实验显示单独的N端剪接域的15N-’H相关谱(HSQC)分散性很差,表现出典型的无折叠蛋白质的化学位移分布,但加入C端剪接域后,显著提高了HSQC谱的信号分散,表现出折叠良好的蛋白质行为。表面等离子体共振和等温滴定微量热实验获得了N端与C端剪接域的结合能力为微摩尔级。这些现象显示N端与C端剪接域相互作用后蛋白质发生了构象变化,表明intein的反式剪接需要有蛋白质的正确识别、结合与折叠的过程,而这一过程必然受到溶液条件的影响(pH、温度等),从而影响反式蛋白质剪接的效率,为调控蛋白质剪接提供了条件。 第四章是关于以结核分支杆菌RecA intein为靶点的抗结核药物研究。基于体外绿色荧光蛋白和大肠杆菌体内TS筛选体系发现,顺铂对RecA intein剪接活性有非常明显的抑制效果,并且对结核菌也有明显的抑制效果。质谱、核磁共振实验以及细菌体内的突变实验结果表明RecA intein的第一个残基Cys1为顺铂的结合位点。这里的研究结果表明顺铂是个潜在的抗结核药物和intein是个潜在的治疗结核病的药物靶点。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q51

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