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《中国科学技术大学》 2017年
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原位蛋白质质谱的开发和应用

李功玉  
【摘要】:常规的蛋白质质谱依赖于包括高效液相色谱和凝胶电泳在内的其他技术对复杂体系中的蛋白质进行分离纯化。一方面,正是这些耗时、离线的分离纯化过程严重改变了蛋白质的生存环境,从而导致质谱检测到的蛋白质并不一定是细胞内蛋白质的真实状态。另一方面,这些样品预处理过程可能会直接导致细胞内低丰度的蛋白质等样品信息丢失。这些蛋白质却可能在某些疾病甚至癌症的发病过程中扮演着不可或缺的角色。而这是相当危险的,因为很多临床诊断、医学鉴定都是基于这些离线检测结果。如果这些结果不可靠,就可能直接误导医生对疾病的诊断、治疗方案的选择等方面的判断。综上所述,开发能够对细胞内的蛋白质相互作用进行直接、快速分析的原位蛋白质质谱方法,无论是从基础理论研究的角度还是生物医学应用的角度都很有意义。本博士研究课题就是旨在开发原位蛋白质质谱。这是一个全新的概念,核心目标是揭示细胞内真实的蛋白质结构和蛋白质相互作用。技术上,核心是利用毫秒级微电泳去除复杂体系中的干扰基质,还包括使用非变性质谱和离子迁移质谱等研究蛋白质相互作用研究的常用手段。应用上,本研究课题可以为蛋白质科学提供可靠的基础研究手段,同时在细胞水平上进行抗癌靶向药物的开发等方面也具有一定的工业应用价值。主要分成如下三个部分开展相关的研究:1)集成连续超快电泳技术,开发原位蛋白质质谱平台。第一部分介绍如何拟集成连续超快电泳技术,开发原位蛋白质质谱平台。搭建超快电泳平台,实现毫秒量级微电泳分离行为:a)搭建直流单脉冲高压电源,实现1赫兹左右的微电泳分离,b)搭建可控连续脉冲电源,实现几赫兹至几千赫兹连续可调的微电泳行为。通过快速电泳,可在毫秒量级内实现复杂基质中的干扰物与目标化合物的初步分离,从而为后续电喷雾降低基质效应。利用高浓度生理盐水等体系来模拟复杂基质,通过对模拟复杂基质中目标化合物的检测效果,来评价其分离能力并研究快速电泳的分离机理。因此,我们设计了毛细管电泳-电喷雾质谱接口、常规尺寸下电喷雾中的离子抑制的缓解以及纳升电喷雾中的离子抑制缓解等几个方面的实验。2)原位蛋白质质谱用于蛋白质分析。本部分主要介绍如何用我们开发的原位蛋白质质谱技术对蛋白质进行结构表征和功能研究。分成如下两部分内容:纯溶液中的蛋白质鉴定分析和复杂体系中的蛋白质鉴定分析。纯溶液中,我们进行了一系列的蛋白质结构相关的研究,包括用原位蛋白质质谱对双硫键蛋白质的一级结构进行测序,以及开发单域蛋白质的折叠结构的可调、梯度地打开新方法,以探究蛋白质的构象变化。复杂体系中的蛋白质鉴定分析,则分别展示了如何用原位蛋白质质谱技术在高盐条件下、胎牛血清中、细胞裂解液以及完整活细胞内进行蛋白质的定性、定量分析。3)原位蛋白质质谱用于蛋白质相互作用分析。这部分我们将介绍原位蛋白质质谱技术在蛋白质相互作用中的应用。主要包含蛋白质-金属离子相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用等几个方面。我们的主要蛋白质模型包括锌指蛋白(NCp7,Sp1等)、钙调蛋白(Calmodulin,CaM)和血红蛋白等。实验场合从纯溶液到细胞内的原位分析,主要技术难点在于实现对完整活细胞的原位蛋白质质谱分析。这种方法避免了复杂的细胞环境造成的干扰问题。以这种方式,我们展示了如何从大肠杆菌细胞快速鉴定完整的蛋白质,包括钙离子与钙调蛋白的络合。后者表现出与体外实验不同的结合状态。这些结果表明,在体外测量的结果并不一定可以用来代替在活细胞内的实际情况。这可能也是很多抗癌药物在体外实验效果良好,但是一旦进入体内或者复杂的肿瘤环境中就失效的原因之一。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:O657.63;O629.73

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