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《中国科学技术大学》 2017年
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线虫辐射损伤信号空间转导与机制研究

黎青青  
【摘要】:长期以来,人们一直认为辐射的损伤效应仅仅存在于被辐照的细胞,而随着辐射旁效应的发现,在非辐照细胞出现与照射细胞类似的生物学效应,对传统的辐射致癌危险性的线性模型以及辐射防护措施提出新的挑战。辐射旁效应成为目前国际上辐射生物学研究领域的热点之一,涉及到辐射损伤信号的产生、传导和响应,以及信号的级联放大过程。目前,尽管辐射旁效应的现象已经被明确,但是对于辐射损伤信号在不同组织中传递的差异还不清楚。相关的信号转导途径是如何参与到辐射旁效应的过程中的,也还没有被阐明。因此,发展新的辐射技术,将研究体系从离体细胞转移到活体水平,在更为精确的条件下分析和研究低剂量辐射的生物学反应,解析其重要的生物学机制,对于辐射防护和肿瘤治疗具有重要意义。本研究基于中国科学院离子束生物学重点实验室的单粒子微束装置和模式生物秀丽隐杆线虫,定点辐射线虫的消化器官后食道球中心和生殖器官阴门部位,研究了辐射旁效应信号在生殖系统内部传递和从消化系统向生殖系统传递的区别,并探索其内在的分子机制。本论文的主要研究结果如下:1.通过CAS-LIBB单粒子微束装置以3.2 MeV的质子对线虫的咽部后食道球中心和阴门部位进行定点定量辐照,结果表明,系统内和系统间的辐射都可以导致辐射旁效应,与辐射食道球的结果相比,对线虫的阴门部位进行定点辐射时,生殖腺细胞凋亡数目更加显著,说明辐射旁效应信号更容易在生殖系统内部传递。不同的组织对辐射表现出不同的敏感性,因此导致了辐射诱导旁效应的差别。并且辐射损伤信号在生殖系统内部转导会引发更严重的遗传损伤效应,导致线虫生殖腺细胞的基因组不稳定性。2.通过对HUS-1::CFP荧光报告品系的应用,我们观察到定点辐射咽部和阴门部位后,旁区生殖细胞中荧光聚点的产生,直接证明了活体水平辐射旁效应导致的DNA损伤的发生。与此同时,对荧光聚点数量的统计显示了两种类型的辐射旁效应导致的损伤程度的区别,即生殖系统内部的辐射旁效应比从消化系统到生殖系统这种系统间的辐射旁效应导致的损伤要更加严重,这与其他的生物学检测终点所反映的结论也是一致的。线虫单基因突变品系hus-1(op241、cep-1(w40)、egl-1(n487)、ced-4(nU162)、ced-3(n717)的使用和全身性 RNA 干扰mrt-2、hus-1、cep-1、ced-4这四个基因,证明DDR途径对于辐射诱导的旁区生殖腺细胞调亡来说是必不可少的。3.为了进一步确定DDR途径的空间功能,我们利用rrf-1和ppw-1线虫突变品系对DDR途径的关键基因进行组织特异性RNA干扰。结果表明,mrt-2/hus-1/cep-1/ced-4主要在辐射旁效应的响应阶段起作用。与系统内辐射损伤信号转导不需要体细胞内的DDR成分相比,在辐射损伤信号从后食道球向生殖细胞传递时,体细胞组织中的DNA损伤检查点MRT-2和HUS-1对系统间辐射导致的生殖细胞凋亡起到部分作用。但总体来看,DDR途径主要还是在辐射旁效应的响应阶段起作用的。4.为了研究辐射后线虫全身的ROS表达水平,我们使用了 GFP标记的线粒体锰超氧化物歧化酶SOD-3表达和线粒体的解折叠蛋白反应的两个荧光报告品系CF1553和SJ4100,以及分子探针H2DCF-DA。结果显示两个位点的辐射都能导致线虫全身性ROS水平的上升,辐射位点的咽部和阴门部位可以观察到局部ROS增强,而通过自由基猝灭剂DMSO处理,可以恢复旁区生殖细胞的凋亡水平,表明氧化损伤在辐射旁效应的转导中起关键作用。5.初步证明了该过程涉及神经酰胺的参与以及神经酰胺与DDR通路的关联。神经酰胺合酶功能的缺失能有效抑制辐射旁效应诱导的生殖细胞凋亡,因为无论是lagr-1(gk327和hyl-1(ok976)基因单突变,还是lagr-1(gk327),hyl-1(ok976)基因双突变品系,线虫的生殖腺细胞凋亡都被明显抑制,而sphk-1(0k1097)基因突变品系并没有导致生殖腺细胞凋亡发生明显的变化,表明神经酰胺生物合成通路参与了线虫辐射诱导旁效应的诱导。在对神经酰胺代谢合酶基因功能缺失后egl-1/ced-13基因mRNA水平表达量的变化进行探究,结果表明神经酰胺和CEP-1可能平行地对辐射诱导的生殖腺细胞凋亡起协同作用。
【关键词】:秀丽隐杆线虫 辐射旁效应 单粒子微束 信号转导 DNA损伤响应途径 组织特异性RNAi 活性氧自 由基
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q691
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-14
  • 第1章 绪论14-42
  • 1.1 辐射生物学14-19
  • 1.1.1 辐射生物学概况14
  • 1.1.2 辐射与生物体作用的原初过程14-15
  • 1.1.3 辐射的生物效应15-17
  • 1.1.4 辐射生物学研究的热点17-19
  • 1.2 辐射诱导的旁效应及其机理19-24
  • 1.2.1 辐射诱导旁效应的研究历史19-20
  • 1.2.2 辐射诱导旁效应的研究体系20-21
  • 1.2.3 辐射诱导旁效应的研究方法21
  • 1.2.4 辐射旁效应研究中的辐照方法21-22
  • 1.2.5 辐射旁效应产生的分子机制22-24
  • 1.3 单粒子微束装置简介24-27
  • 1.3.1 采用单粒子微束进行生物学研究的发展概况24-25
  • 1.3.2 CAS-LIBB单粒子微束装置简介25-27
  • 1.4 秀丽隐杆线虫27-34
  • 1.4.1 秀丽隐杆线虫的研究历史28-30
  • 1.4.2 秀丽隐杆线虫作为模式生物的优点30-31
  • 1.4.3 秀丽隐杆线虫的共享资源31-33
  • 1.4.4 线虫的辐射生物学研究33-34
  • 1.5 本论文的研究目的和主要内容34
  • 参考文献34-42
  • 第2章 辐射损伤信号在线虫个体上的转导效应42-56
  • 2.1 前言42-43
  • 2.2 材料与方法43-47
  • 2.2.1 线虫品系和试剂43
  • 2.2.2 线虫培养43-44
  • 2.2.3 线虫的同步化处理44
  • 2.2.4 单粒子微束定点定量辐照线虫44-45
  • 2.2.5 生殖腺细胞凋亡数目的测定45-46
  • 2.2.6 寿命的测定46
  • 2.2.7 线虫产卵率的检测46
  • 2.2.8 数据统计分析46-47
  • 2.3 结果与分析47-51
  • 2.3.1 定点辐射诱导旁区生殖腺细胞凋亡47-48
  • 2.3.2 辐射旁效应与辐射剂量的关系48-49
  • 2.3.3 定点辐射对线虫平均寿命的影响49-50
  • 2.3.4 定点辐射线虫导致子代的遗传损伤50-51
  • 2.4 讨论51-53
  • 参考文献53-56
  • 第3章 单束定点辐射线虫诱导的HUS-1::GFP聚集及DNA损伤通路的研究56-70
  • 3.1 前言56-57
  • 3.2 材料与方法57-61
  • 3.2.1 线虫品系和试剂57-58
  • 3.2.2 线虫培养及同步化处理58
  • 3.2.3 HUS-1::GFP聚集点的观察与统计58
  • 3.2.4 RNAi干扰58-59
  • 3.2.5 产生dsRNA的L4440质粒构建59-61
  • 3.2.6 数据统计分析61
  • 3.3 结果与分析61-66
  • 3.3.1 定点辐射导致旁区HUS-1::GFP聚集点数目的增加61-63
  • 3.3.2 重组质粒菌种的构建63-64
  • 3.3.3 DNA损伤响应途径参与辐射诱导的旁效应64-66
  • 3.4 讨论66-68
  • 参考文献68-70
  • 第4章 利用组织特异性RNAi方法探究DNA损伤通路的空间功能70-84
  • 4.1 前言70-72
  • 4.2 材料与方法72-75
  • 4.2.1 线虫品系和试剂72
  • 4.2.2 线虫培养及同步化处理72
  • 4.2.3 组织特异性RNAi干扰72
  • 4.2.4 生殖腺细胞凋亡数目的测定72-73
  • 4.2.5 实时定量RT-PCR分析73-74
  • 4.2.6 γ源全身辐照实验74
  • 4.2.7 数据统计分析74-75
  • 4.3 结果与分析75-80
  • 4.3.1 对组织特异性RNAi实验体系的验证75-78
  • 4.3.2 DDR在咽部辐射旁效应中的空间作用78-79
  • 4.3.3 DDR在阴门部位辐射旁效应中的空间作用79-80
  • 4.4 讨论80-81
  • 参考文献81-84
  • 第5章 活体水平诱导的辐射旁效应与氧化应激的关联84-92
  • 5.1 前言84-85
  • 5.2 材料与方法85-86
  • 5.2.1 线虫品系和试剂85-86
  • 5.2.2 线虫培养及同步化处理86
  • 5.2.3 线虫体内自由基表达水平检测86
  • 5.2.4 数据统计分析86
  • 5.3 结果与分析86-89
  • 5.3.1 定点辐射导致线虫体内ROS水平上升86-87
  • 5.3.2 定点辐射后对线虫体内ROS的原位检测87-88
  • 5.3.3 自由基清除剂对旁区生殖细胞凋亡的拯救作用88-89
  • 5.4 讨论89-90
  • 参考文献90-92
  • 第6章 神经酰胺及其代谢通路在旁效应转导中的作用92-102
  • 6.1 前言92-93
  • 6.2 材料与方法93-96
  • 6.2.1 线虫品系和试剂93-94
  • 6.2.2 线虫培养及同步化处理94
  • 6.2.3 生殖腺细胞凋亡数目的测定94
  • 6.2.4 实时定量RT-PCR分析94-96
  • 6.2.5 数据统计分析96
  • 6.3 结果与分析96-98
  • 6.3.1 神经酰胺代谢途径基因功能缺失后对辐射旁效应的影响96-98
  • 6.3.2 神经酰胺代谢合酶基因功能缺失后对egl-1/ced-13基因表达量的影响98
  • 6.4 讨论98-99
  • 参考文献99-102
  • 结论102-104
  • 致谢104-106
  • 攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议106-108
  • 附录108

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