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《中国科学技术大学》 2017年
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基于微流控芯片的中性粒细胞运动及趋化性研究

杨柯  
【摘要】:免疫细胞趋化性在免疫反应中发挥着重要作用,进一步开展免疫细胞趋化性研究具有十分重要的意义。微流控芯片可以生成精确可控的浓度梯度,是一种理想的免疫细胞趋化性研究工具。然而,在缺乏专业设备和技术人员的情况下使用微流控芯片非常困难,阻碍了微流控芯片在生物和医学研究领域中推广。本论文针对细胞趋化性研究领域所面临的一系列问题,开发了相应的微流控芯片,旨在为免疫细胞趋化性研究提供易于使用和实用的解决方案。首先,开发了一种集成细胞全血分离和细胞预富集功能的微流控芯片,可快速地从全血中筛选中性粒细胞,有利于提高实验效率和分析精度。通过检测中性粒细胞对趋化因子(N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine,fMLP)和慢性阻塞性肺病病人(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)痰液样本的趋化性验证了基于微流控芯片的全血分离方法。在此基础上,进一步设计了集成多区细胞校准和梯度生成功能的微流控芯片(Dual-Docking Device),使其具备中性粒细胞趋化性和细胞趋化性记忆效应实验研究的双重功能。研究结果支持在简单二维平面上使用偏向随机运动(bias-random-walk)描绘中性粒细胞趋化性,且证明了趋化性记忆效应不仅与趋化物化学浓度相关,而且与细胞"过去和现在"所经历的梯度环境有关。为进一步提高实验效率,我们开发了具有三个平行梯度通道的微流控芯片,该芯片允许在单一显微镜视野(10X物镜)中同时开展三组不同物理条件下的细胞趋化性实验,有利于节省时间成本、降低劳动强度,并保证了实验的真实性与可靠性。使用三通道微流控芯片研究了与慢性肾病相关的生物标志物成纤维生长因子 23(Fibroblast growth factor 23,FGF23),并首次阐述了 FGF23 影响中性粒细胞趋化性的过程,揭示了研究FGF23介导的中性粒细胞趋化性对研究疾病发病机理和制定相关治疗方案的重要意义。最后,针对当前细胞趋化性研究需要依托昂贵的显微镜且时间和实验成本较高等缺点,开发了基于微流控芯片和智能手机的细胞迁移运动研究专用实时成像系统。该系统集成了微流控芯片、活细胞成像、实验环境控制和数据分析功能,可快速、实时采集实验数据并实现自动化的分析,极大提高了细胞迁移实验的效率。总之,本论文研究成果为基于微流控芯片技术的细胞趋化性研究设备的开发提供了设计思想和实验依据,所开发的微流控芯片有望被广泛用于细胞趋化性实验研究。
【关键词】:免疫细胞 中性粒细胞 趋化性 微流控芯片
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q2-33
【目录】:
  • 摘要5-6
  • ABSTRACT6-11
  • 第1章 绪论11-25
  • 1.1 细胞趋化性概述11-12
  • 1.1.1 细胞趋化性简介11
  • 1.1.2 细胞趋化性的生理作用简介11
  • 1.1.3 细胞趋化性的诱导机制简介11-12
  • 1.2 传统的趋化性研究设备简介12-13
  • 1.3 微流控芯片简介13-15
  • 1.3.1 微流控芯片的研究历史13-14
  • 1.3.2 微流控芯片的研究现状14-15
  • 1.3.3 微流控芯片的制备方法15
  • 1.4 基于微流控芯片的细胞趋化性研究15-22
  • 1.4.1 基于层流扩散技术的细胞迁移研究芯片16-17
  • 1.4.2 基于窄细通道扩散技术的细胞迁移研究芯片17-19
  • 1.4.3 基于三维凝胶扩散技术的细胞迁移研究芯片19-20
  • 1.4.4 基于微流控芯片的细胞趋化性临床应用研究20-22
  • 1.5 本论文选题以及主要研究内容22-25
  • 1.5.1 选题依据及意义22-23
  • 1.5.2 主要研究内容和预期目标23-25
  • 第2章 集成细胞全血分离的微流控芯片设计、制备及实验25-33
  • 2.1 微流控芯片的研究背景25-26
  • 2.2 微流控芯片的制备方法26-31
  • 2.2.1 微流控芯片的制备26-28
  • 2.2.2 试剂准备28-30
  • 2.2.3 实验操作30
  • 2.2.4 趋化性实验30
  • 2.2.5 细胞趋化性数据分析30-31
  • 2.3 微流控芯片的实验结果31-32
  • 2.4 小结32-33
  • 第3章 基于微流控芯片的中性粒细胞偏向随机运动和记忆效应实验研究33-52
  • 3.1 引言33-35
  • 3.2 材料与方法35-38
  • 3.2.1 微流控芯片的设计与制备35
  • 3.2.2 梯度测量与计算机仿真35-36
  • 3.2.3 细胞准备36
  • 3.2.4 细胞趋化性实验36-37
  • 3.2.5 细胞追踪和数据分析37-38
  • 3.2.6 细胞趋化性模型及仿真38
  • 3.3 结果38-50
  • 3.3.1 D~2-Chip的设计38-40
  • 3.3.2 D~2-Chip研究中性粒细胞的趋化性40-42
  • 3.3.3 Bias-random-walk运动模式实验研究42-44
  • 3.3.4 Bias-random-walk计算机仿真模型开发44-48
  • 3.3.5 中性粒细胞的趋化性记忆效应实验研究48-50
  • 3.4 小结50-52
  • 第4章 基于微流控芯片的FGF23影响中性粒细胞趋化性研究52-64
  • 4.1 引言52-53
  • 4.2 材料与方法53-57
  • 4.2.1 微流控芯片的设计与制备53
  • 4.2.2 细胞准备53
  • 4.2.3 FGF23前处理和细胞趋化性实验53-54
  • 4.2.4 细胞趋化性数据分析54-57
  • 4.3 结果57-62
  • 4.3.1 C~3-Chip和D~3-Chip性能测试57-58
  • 4.3.2 C~3-Chip研究FGF23对中性粒细胞趋化性的影响58-60
  • 4.3.3 D~3-Chip研究FGF23对中性粒细胞趋化性的影响60-61
  • 4.3.4 PCA分析细胞趋化性数据61-62
  • 4.4 小结62-64
  • 第5章 基于微流控芯片和智能手机的细胞迁移专用实时成像系统64-74
  • 5.1 引言64-65
  • 5.2 材料与方法65-69
  • 5.2.1 M_(kit)组成部分65-68
  • 5.2.2 细胞准备68
  • 5.2.3 细胞趋化性实验68-69
  • 5.3 结果69-73
  • 5.3.1 M_(kit)的图像性能69-70
  • 5.3.2 M_(kit)的实验验证70-73
  • 5.4 小结73-74
  • 第6章 全文总结与展望74-77
  • 6.1 全文工作总结74
  • 6.2 论文创新点74-75
  • 6.3 有待研究的问题75-77
  • 附件1 芯片制备所需材料清单77-79
  • 附件2 趋化熵代码79-82
  • 附件3 随时间变化趋化熵代码82-86
  • 附件4 Bias-random-walk计算机仿真模型代码86-93
  • 致谢93-94
  • 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果94-95
  • 参考文献95-108

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