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《中国科学技术大学》 2017年
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人源蛋白质ARAP3选择性识别RhoA的结构基础以及拟南芥蛋白质APUM23特异性识别18S核糖体RNA的结构基础

鲍洪宇  
【摘要】:本论文的第一章介绍了我们关于含有两个GTP酶激活蛋白质结构域的人源蛋白质ARAP3选择性识别RhoA的结构与功能研究。ARAP3是一个多结构域的蛋白质,它含有1个ArfGAP结构域、1个RhoGAP结构域、1个SAM结构域、5个PH结构域、以及1个RA结构域。ARAP3的特点是同时拥有两个具有活性的GTP酶激活蛋白质结构域,其中ArfGAP可以选择性地识别并加速Arf6-GTP水解为Arf6-GDP,RhoGAP可以选择性地识别并加速RhoA-GTP水解为RhoA-GDP。PtdIns(3,4,5)P3与 ARAP3 的结合可以提高 ArfGAP 的活性,Rap1-GTP与ARAP3的结合可以提高RhoGAP的活性。ARAP3很多生物学功能都与它的RhoGAP结构域的活性有关,如参与板状伪足的形成、参与血管生成、抑制硬胃癌细胞的腹膜扩散、调节中性粒细胞的趋化性和粘附相关过程、以及参与神经突生长等。为了更清晰的了解ARAP3是如何特异性识别RhoA,我们解析了 ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA·GDP·AlF4-在反应过渡态的复合物晶体结构。ARAP3的RhoGAP结构域由9个长的α螺旋和2个短的α螺旋反向平行折叠组成。我们对复合物结构提供的作用界面上的氨基酸进行突变,并通过细胞外1TC实验以及酶动力学实验研究了这些氨基酸对RhoGAP结构域识别RhoA以及加速RhoA-GTP水解能力的影响。我们发现对ARAP3的氨基酸的Arg-942、Arg-949、Arg-982或Arg-985的单点突变都可以显著的降低ARAP3-RhoGAP结构域与RhoA-GTP的结合能力以及GAP活性。我们还发现ARAP3是通过RhoA的α3螺旋中的氨基酸Asp-90和Glu-97来选择RhoA作为特异性作用底物的。本论文的第二章介绍了我们关于拟南芥中的PUF蛋白质APUM23特异性识别18S核糖体RNA中11个核苷酸的5'-GGAAUUGACGG-3'序列的结构与功能研究。多年来PUF蛋白质得到了广泛的结构与功能研究,但是我们对植物中的PUF蛋白质仍然知之甚少。大部分的PUF蛋白质都存在于细胞质中,它们通过结合信使RNA的3'非翻译区来调控信使RNA的翻译及定位。APUM23是少数的存在于核仁中的PUF蛋白质,它参与调节前核糖体RNA的加工过程,然而其中的分子机制目前尚不清楚。我们解析了 APUM23和目的RNA的复合物晶体结构,这是第一个解析出的植物中的PUF蛋白质结构,APUM23是由10个Puf repeat串联结构域折叠成的C型结构,APUM23有一段插入序列并在C型结构内侧折叠成α螺旋。这段插入序列参与RNA的识别。最后,我们还解析了不含插入氨基酸序列的APUM23的突变体和RNA 5'-GGAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构。这个复合物结构显示,Go的碱基不再与APUM23的第十个Puf repeat结构域结合,而是经过大角度的翻转和A-3的碱基形成堆积相互作用稳定A+3碱基的构象。插入氨基酸序列的存在会通过空间位阻限制Go碱基的翻转,因此APUM23的插入氨基酸序列既识别RNA的碱基,又可以稳定RNA的构象。这项工作揭示了APUM23特异性识别18S核糖体RNA的结构基础。
【关键词】:ARAP3 GTP酶激活蛋白质 RhoGAP的特异性 APUM23 RNA结合蛋白质 核糖体RNA PUF蛋白质
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q51;Q78
【目录】:
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-13
  • 第1章 人源蛋白质ARAP3选择性识别RHOA的结构基础13-57
  • 1.1 背景介绍13-26
  • 1.1.1 引言13
  • 1.1.2 小GTP酶13-14
  • 1.1.3 Rho家族小GTP酶14-15
  • 1.1.4 Rho家族小GTP酶的调控蛋白质15-17
  • 1.1.5 RhoA的生物学功能17
  • 1.1.6 Arf6的生物功能17-18
  • 1.1.7 ARAP3是多结构域蛋白质18
  • 1.1.8 ARAP3的ArfGAP结构域活性的调节18-19
  • 1.1.9 ARAP3的RhoGAP结构域活性的调节19-20
  • 1.1.10 ARAP3的生物功能20-23
  • 参考文献23-26
  • 1.2 材料方法26-41
  • 1.2.1 蛋白质边界的选择26
  • 1.2.2 目的基因片段的扩增26-27
  • 1.2.3 目的基因片段的回收27-28
  • 1.2.4 质粒和目的基因的双酶切28
  • 1.2.5 目的基因片段克隆到质粒28-29
  • 1.2.6 大肠杆菌化学转化感受态细胞Gold的制备29
  • 1.2.7 连接产物转化至大肠杆菌感受态29-30
  • 1.2.8 测序及菌种的保存30
  • 1.2.9 质粒的突变30-31
  • 1.2.10 RhoA、Cdc42以及Rac1的克隆31
  • 1.2.11 ARAP3-RhoGAP-RhoA (2-181,F25N)融合蛋白质的克隆31-32
  • 1.2.12 ARAP3的RhoGAP结构域的表达与纯化32-33
  • 1.2.12.1 带有His-tag的目的蛋白质的Ni柱亲和纯化32-33
  • 1.2.12.2 凝胶过滤柱层析(分子筛)进一步纯化目的蛋白质33
  • 1.2.12.3 蛋白质的浓缩及更换缓冲液33
  • 1.2.13 人源RhoA、Cdc42以及Rac1的表达和纯化33
  • 1.2.14 ARAP3-RhoGAP-RhoA (2-181,F25N)融合蛋白质的表达与纯化33
  • 1.2.15 晶体筛选优化33-34
  • 1.2.16 蛋白质晶体的X-射线衍射数据的收集34-35
  • 1.2.16.1 蛋白质晶体防冻保护剂34
  • 1.2.16.2 对中晶体34
  • 1.2.16.3 调整像板距离34
  • 1.2.16.4 合适的光强34-35
  • 1.2.16.5 选择合适的摆角35
  • 1.2.16.6 选择合适的收集角度35
  • 1.2.17 数据处理和结构解析35
  • 1.2.18 等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)实验35-37
  • 1.2.19 酶活力实验37-39
  • 参考文献39-41
  • 1.3 实验结果41-51
  • 1.3.1 引言41
  • 1.3.2 ARAP3的RhoGAP结构域的单体结构41-43
  • 1.3.3 ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA的过渡态复合物结构43-45
  • 1.3.4 ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA的相互作用界面45-47
  • 1.3.5 ARAP3-RhoGAP-RhoA过渡态复合物结构与其他RhoGAP·RhoA过渡态复合物结构的比较47-50
  • 1.3.6 ARAP3选择性识别RhoA的结构生物学机制50-51
  • 1.4 讨论51-57
  • 参考文献55-57
  • 第2章 拟南芥蛋白质APUM23特异性识别18S核糖体RNA的结构基础57-107
  • 2.1 背景57-74
  • 2.1.1 PUF蛋白质的功能57-61
  • 2.1.1.1 PUF蛋白质抑制mRNA的表达57-58
  • 2.1.1.2 PUF蛋白质激活mRNA的翻译58-59
  • 2.1.1.3 PUF蛋白质调节mRNA的定位59-60
  • 2.1.1.4 核仁定位的PUF蛋白质调节前核糖体RNA加工60-61
  • 2.1.2 PUF蛋白质的结构61-62
  • 2.1.3 PUF蛋白质对特异性RNA序列的模块化识别62-63
  • 2.1.4 PUF蛋白质的应用63-65
  • 2.1.5 APUM23的功能65-69
  • 参考文献69-74
  • 2.2 材料和方法74-82
  • 2.2.1 APUM23的Puf-repeat串联结构域的克隆74-76
  • 2.2.1.1 蛋白质边界的选择74
  • 2.2.1.2 目的基因片段的扩增74-75
  • 2.2.1.3 表达质粒的克隆75
  • 2.2.1.4 点突变体及片段删除型突变体的构建75-76
  • 2.2.2 APUM23的Puf-repeat串联结构域的表达与纯化76-79
  • 2.2.2.1 LB培养基和LR培养基配方76
  • 2.2.2.2 硒代甲硫氨酸标记的蛋白质(Se-Met-APUM23~(85-655))的表达76-77
  • 2.2.2.3 APUM23的Puf-repeat串联结构域的表达77
  • 2.2.2.4 APUM23的Puf-repeat串联结构域的纯化77-79
  • 2.2.3 RNA母液的制备79
  • 2.2.4 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的生长79-80
  • 2.2.5 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的X-射线衍射数据的收集80
  • 2.2.6 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的X-射线衍射数据处理与结构解析80-81
  • 2.2.7 等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)实验81
  • 参考文献81-82
  • 2.3 实验结果82-98
  • 2.3.1 APUM23与10个核苷酸的RNA5'-GAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构82-84
  • 2.3.2 APUM23与11个核苷酸的RNA5'-GGAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构84
  • 2.3.3 APUM23对A_(+2)和A_(+7)的特异性模块化识别84-88
  • 2.3.4 APUM23对G_0、G_(+1)、G_(+6)、G_(+9)和G_(+10)的特异性模块化识别88
  • 2.3.5 APUM23对C_(+8)的特异性模块化识别88-89
  • 2.3.6 APUM23对A_(+3)的识别89
  • 2.3.7 APUM23对U_(+4)和U_(+5)的识别89-92
  • 2.3.8 APUM23以及Nop9和相同RNA5'-GGAAUUGACGG-3'复合物晶体结构的比较92-94
  • 2.3.9 APUM23的R3 Puf repeat结构域的插入氨基酸序列阻碍了G_0和A_(+3)碱基之间的堆积94-98
  • 2.4 讨论98-107
  • 2.4.1 APUM23是新型结构的PUF蛋白质98-99
  • 2.4.2 APUM23和Nop9家族蛋白质的R3 Puf repeat结构域都存在比较保守插入氨基酸序列99-100
  • 2.4.3 APUM23调控前核糖体RNA加工的可能分子机制100-103
  • 2.4.4 APUM23潜在的应用前景103-104
  • 2.4.5 不足之处104
  • 参考文献104-107
  • 致谢107-108
  • 在读期间发表的学术论文和取得的研究成果108

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