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《中国科学技术大学》 2019年
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金黄色葡萄球菌噬菌体80αSak结构生物学研究和光修复酶phr相关蛋白表达纯化

朱孔福  
【摘要】:第一部分:金黄色葡萄球菌噬菌体80α Sak的结构生物学研究Sak蛋白最早是在乳酸链球菌噬菌体u136中鉴定并命名的,与其它噬菌体来源的重组酶构成Sak家族。u136 Sak是目前唯一得到结构解析的Sak家族蛋白,电镜负染结构表明其为11聚体圆环状结构,与人源Rad52蛋白N端结构域类似,被认为是Rad52的早期进化源蛋白之一。根据序列、结构或功能上的相似性,Sak家族被划为Rad52-like超家族,Sak家族蛋白的相关研究,有利于揭示Rad52类似蛋白的作用机制。金黄色葡萄球菌是一种人类致病菌,最近在金黄色葡萄球菌噬菌体80α基因组复制研究中,鉴定得到80α Sak蛋白,根据序列和功能上的相似性,该蛋白被划入Sak家族,并且与人源Rad52端N结构域在体外功能上类似,可能是人源Rad52蛋白的同源蛋白。Rad52是双链DNA断裂(DSB)修复的核心蛋白之一,可以以Rad51依赖型和Rad51非依赖型两种方式参与DSB的同源重组修复。为阐明Rad52的具体作用机制,人源Rad52 N端及其与核酸复合物的晶体结构得到解析。研究结果显示,Rad52在溶液状态下,呈11聚体环状结构,内部疏水,表面亲水并含两个DNA结合位点。无规则构象的单链DNA首先结合外结合位点,在一定作用力下打开β夹子,滑落至内结合位点。在该位点,Rad52与核酸磷酸骨架相互作用,使其形成利于配对的B型结构,完成退火反应。冷冻电镜图片结果符合11聚体圆环结构,但在单链DNA加入后,Rad52组装形成较多复杂的圆环或类圆环的网络堆积,目前其组装机制并无详细报导。由于人源Rad52蛋白在过去近20年的研究中无论从电镜还是晶体的角度都未能成功阐明圆环结构到圆环堆积结构的组装机制,且本实验室长期致力于金葡菌相关蛋白研究,故而我们拟以金葡菌噬菌体80α Sak为研究对象,对其电镜结构进行解析。在本文中,我们从进化、结构及功能上确定了 80α Sak与人源Rad52 N端是同源蛋白,并使用冷冻电镜对80α Sak溶液结构进行了三维重构。重构结果表明80α Sak在溶液中以单环、螺旋环和双环三种结构存在,且双环存在“面对面”和“背对面”两种构象。动态光散射、静态光散射和分子排阻层析实验对重构结果进行了支撑。DNA与80α Sak孵育后的负染结构表明,双环结构是圆环堆积体的主体结构单元。故我们认为在溶液状态,单环结构是80αSak的主体结构,部分单环结构可经过螺旋结构过渡形成双环结构,双环结构可组装成较低聚集度的圆环堆积链,加入单链DNA后,圆环堆积链聚集度提升,可能是80α Sak与核酸的主要作用形式。该发现,对更好的理解Rad52相关蛋白的作用机制有一定启发作用。第二部分:光修复酶phr相关蛋白的表达纯化太阳光紫外线对生物个体的影响是多面的。植物和自养微生物能利用太阳光合成糖类化合物,进而转化成其它活性物质或生物能。人体也能利用紫外线进行维生素D的转化合成。然而紫外线照射会引起CPD、6-4PP等多种类型的DNA光损伤。光修复系统在生物界保守,是光损伤修复的主要执行者。但人类等哺乳动物中并无光损伤修复系统,而是通过核苷酸切除反应去除损伤位点,修复过程较长,效率较低,造成CPD累积引发人体皮炎、皮疹、黑色素堆积甚至皮肤癌。为应对太阳光紫外线损伤,常用方法为涂抹防晒霜。但由于目前所用防晒品具有一定的限制,我们希望通过在己知具有较高修复活性的植物或藻类中寻求合适的光修复系统进行研究,为其作为防晒品添加剂的工业化应用奠定基础。通过文献查阅和数据库检索,我们拟对具有300多年食用历史的钝顶螺旋藻进行光修复酶蛋白的纯化和酶活测定。在本研究中,我们对钝顶螺旋藻光修复酶phr及其突变体蛋白和大肠杆菌phr蛋白进行了大肠杆菌表达系统的表达纯化,以大肠杆菌phr为阳性对照,确定了钝顶螺旋藻phr同时具有单链和双链DNA损伤修复活性,相关蛋白的表达纯化和酶活研究为钝顶螺旋藻phr更深层次的机制研究提供样品,为其工业化应用奠定基础。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R378.11

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