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CENP-E马达蛋白作用网络在细胞有丝分裂中的功能研究

刘丹  
【摘要】: 细胞周期是细胞复制的过程,在此过程中子细胞生长并且发育为一个完整的生命体。细胞周期中最为重要的事件是那些涉及遗传物质的复制和分配的过程,即染色质DNA的复制与有丝分裂期姐妹染色体的分离。每个事件的开始都受到精确的调控,并且事件执行过程中的错误可以被修正。有丝分裂过程中染色体的运动和分离是由定位于染色体着丝粒部位的动点复合物与动态的微管的相互作用来调节的。 CENP-E是维持稳定的动点—微管连接和纺锤体检查点功能的至关重要的一个大分子马达蛋白。我的研究目的即寻找其相互作用蛋白质,并进一步揭示它在动点上的功能行使机制。最初,我们选用了位于CENP-E中间的coiled-coil区域(HpX955-1571氨基酸)作为诱饵,进行了酵母双杂交筛选,在大概二十个阳性克隆中,我们挑选了skp1进行进一步的功能研究。Skp1是Ubquitin介导的蛋白降解途径中一个至关重要的E2连接酶-SCF(skp1-cullin-F_box)的固定组分,此二者的相互作用很可能与CENP-E的降解相关联。在此基础上,我们进行了进一步的生化和细胞学的分析,发现此二者的相互作用很可能发生在细胞分裂末期的中体(midbody)区域。在作用过程中,CENP-E先集中在中体上,并且随着skp1在中体上的积聚,CENP-E的量越来越少,最终消失,母细胞完全分裂为两个均等的子细胞。接下来,我们用RNA干扰技术系统评估了skp1在有丝分裂末期的具体功能,发现缺少了skp1的HeLa细胞无法完成正常的有丝分裂过程,而更多的以四连细胞的形式存在,从而证明了skp1对于正常细胞周期行进所不可缺少的功能。为了证明该功能是否与CENP-E的相互作用有关,我们将缺失了CENP-E相互作用区域的skp1转入HeLa细胞,发现了与skp1敲除相似的表型,因此,我们推断CENP-E与skp1的相互作用对于有丝分裂末期的中体调控有着非常重要的意义。 接下来我们的工作发现原始的CENP-E序列缺失了2131-2167这一段的36个氨基酸,为了寻找这一段序列的功能,同时寻找CENP-E在动点上可能的相互作用蛋白以及功能行使机制,我们再次选用了它C末端的两段序列(2167-2701氨基酸以及2131-2701氨基酸)进行酵母双杂交的筛选,在这两个筛选的结果里面,我们都发现了一个已知的动点蛋白-Nuf2。Nuf2可以与Hec1形成一个稳定的复合物,并且凭借其在稳定动点-微管连接中不可或缺的作用而为人们所熟知。而CENP-E也一直被认为在该方面有不可替代的功能。鉴于二者在功能上的相似性,我们怀疑他们协同作用从而稳定动点-微管的连接,但二者是不是一个并列的关系呢?为了回答这个问题,我们利用siRNA技术,分别抑制Nuf2,CENP-E以及Hec1的表达,然后看其他两个蛋白在动点上的定位情况,结果发现,Nuf2和Hec1的敲除均可以在一定程度上影响CENP-E的定位,而CENP-E表达与否对Nuf2和Hec1则没有任何影响,同时,三者的单独敲除和两两的共敲除会不同程度地破坏动点-微管的稳定连接,当CENP-E和Nut2同时敲除时对动点-微管连接的影响最大。因此,我们认为CENP-E和Nuf2-Hec1复合物是协同作用来稳定动点-微管的连接的,二者相辅相成,缺一不可,最有可能的方式是通过CENP-E来加固Nuf2-Hec1复合物与微管的连接作用,同时,该复合物也稳定了CENP-E在动点外层的定位。 综上所述,CENP-E是一个在有丝分裂过程中功能很丰富的蛋白,在有丝分裂中期的时候,Nuf2-Hec1复合物在CENP-E的帮助下完成微管捕捉和稳定的作用,从而令染色体整齐的排列在赤道板上,等待后期的分裂,而在其任务完成后,CENP-E会集中于两个子细胞中间的中体位置,并且被SCF介导的Ubquitin化进程降解。


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