血红素和西罗血红素分支合成关键酶的结构生物学研究

【摘要】： 1．玉米尿卟啉原甲基化酶的功能片段的确定依赖于S-腺苷甲硫氨酸的尿卟啉原甲基化酶(S-adenosyl-L-methionine：uroporphyrinogen methyltransferase，SUMT)是微生物合成西罗血红素、血红素d1、F_(430)因子和维生素B_(12)等卟吩烷类化合物的重要调控酶，植物中SUMT负责西罗血红素生物合成的调控。SUMT催化尿卟啉原Ⅲ在C2和C7位的甲基化，大肠杆菌重组表达的SUMT会在细胞中积累西罗叶绿三酸和过甲基化产物三甲基咕啉，它们在紫外光下产生强烈红色荧光，这种性质可用于检测SUMT在重组系统的体内酶活。 利用不同的限制性内酶切，将编码玉米SUMT的基因切成不同片段，分别插入不同的表达载体中，表达的蛋白分别是玉米SUMT，含有叶绿体导肽的SUMT前体，切除SUMT的N端S-腺苷甲硫氨酸结合模块的截头突变体，和切除SUMT的C端52个氨基酸残基的截尾突变体。其中，SUMT和截尾突变体N端含有组氨酸标签。将所有重组表达载体转化大肠杆菌JM109，结果显示表达融合叶绿体导肽的SUMT前体和截头突变体的重组大肠杆菌菌落没有红色荧光。蛋白检测显示表达的重组蛋白为包涵体，表明叶绿体导肽和SAM结合模块影响酶在大肠杆菌中的折叠。而表达SUMT的N端分别融合表达一段13个氨基酸残基的寡肽、或组氨酸标签，或麦芽糖结合蛋白，重组大肠杆菌菌落显示红色荧光；表达截尾突变体的重组菌落显示红色荧光，表明SUMT的C端52个氨基酸残基对酶活没有显著作用。 分别将表达玉米SUMT和截尾突变体的表达质粒转化大肠杆菌S13009，诱导表达，利用Ni-NTA层析一步纯化了玉米SUMT及截尾突变体，纯度在90％以上。玉米SUMT的亚基分子量在SDS-PAGE上测定约34 kD，凝胶层析测得全酶分子量为52 kD，动态光散射测定全酶分子量约79 kD，表明玉米SUMT是同亚基二聚体。纯化的蛋白结合红色荧光色素。 从纯化的玉米SUMT中分离色素，利用紫外-可见光谱和荧光光谱确定酶结合色素的主要成分是三甲基咕啉，而玉米SUMT氨基酸残基干扰结合色素的荧光激发峰。圆二色性分析表明，去除色素后，玉米SUMT的二级结构有轻微改变，对色素的产生及结合蛋白的可能机制进行了讨论。 2．枯草杆菌尿卟啉原脱羧酶的结构研究 尿卟啉原脱羧酶(Uroporphyrinogen decarboxylase，UROD)是血红素和叶绿素分支合成的第一个酶，控制着生物体内不同卟啉化合物代谢的流向。它催化尿卟啉原Ⅲ或异构体尿卟啉原Ⅰ四次脱羧产生粪卟啉原Ⅲ或Ⅰ，和一般的脱羧酶不同，UROD不含有辅因子。 利用PCR技术从枯草杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA扩增了编码UROD的基因hemE，测序显示编码的UROD有两个氨基酸残基发生改变，分别是Ile155被Thr155取代，Glu198被Lys198取代，扩增产物酶切后插入pET 15b中，表达的枯草杆菌UROD(B．subtilis UROD，bsUROD)N端含有组氨酸标签，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，Ni-NTA一步纯化，蛋白纯度在90％以上。酶的比活为560 U／mg蛋白。纯化的bsUROD亚基分子量在SDS-PAGE上测定约41kD，动态光散射测定全酶分子量约81 kD，表明bsUROD是同亚基二聚体。 利用悬滴法获得bsUROD的晶体，收集到分辨率为2.3(?)的晶体衍射数据，以人UROD的结构作为模型，利用分子置换法解析了bsUROD的晶体结构，晶体空间群为P_1，在bsUROD的模型中，一个晶胞中有四个UROD单体，晶胞参数a=58.612(?)，b=80.410(?)，c=90.940(?)，α=68.681°，β=89.638°，γ=80.817°，bsUROD的最终模型的自由R因子和晶体学R因子分别为19.74％和25.13％，键长和键角的RMSD分别为0.012(?)和1.290°。bsUROD的结构已经投入PDB(PDB code：2INF)。 解析的bsUROD单体结构包括6-88和101-349氨基酸残基，单体只有一个结构域，由(β／α)_8桶折叠组成，酶活中心呈现凹穴结构，利用hUROD和产物粪卟啉Ⅲ的复合物结构，将粪卟啉Ⅲ的结构和bsUROD进行空间叠合，结果显示，bsUROD酶活中心有18个氨基酸残基和粪卟啉Ⅲ有接触，根据对底物的识别和脱羧的功能将它们分为3类。第一类是Asp残基；第二类包含数个极性氨基酸残基；第三类包括数个疏水氨基酸残基。在18个氨基酸残基中，只有Arg29，Arg33，Asp78，Ile79，Phe104，Tyr154，Phe207和His322在30个物种的UROD中是不变的。对它们可能的功能作了讨论。 bsUROD和真核生物UROD结构比较发现有两个loop差别很大，这两个loop的构象变化可能涉及底物的结合和产物的释放。由于UROD和SUMT催化相同的底物，推测SUMT结合尿卟啉原吡咯环NH基团的氨基酸残基和bsUROD一致。 根据bsUROD和催化产物的模拟结构，我们提出了一种新的催化机制，bsUROD中Arg29可能参与脱羧，而Phe144和／或Phe207可能参与捕获二氧化碳分子。 3．参与血红素，西罗血红素和NAD生物合成的酶的纯化及结晶 生物中血红素和西罗血红素是个多功能分子，参与它的生物的酶的结构和功能的研究近年来有很大进展。3-羟邻氨基苯甲酸双加氧酶(3-Hydroxyanthranilic acid 3，4-dioxygenase，HAO)是NAD合成途径中关键调控酶。 我们分别克隆、表达和纯化了枯草杆菌合成血红素的上游和中游的酶，以及西罗血红素分支合成的酶，收集了两个酶的晶体衍射数据，同时分别克隆、表达和纯化了酿酒酵母合成血红素合成下游两个酶和HAO，收集了HAO的晶体衍射数据，由另一同学解析了结构。 根据晶体生长的统计结果，对生物信息技术在蛋白晶体生长的作用，及组氨酸标签在蛋白表达、纯化和晶体生长中的应用、存在问题等作了简要的讨论。