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血红素和西罗血红素分支合成关键酶的结构生物学研究

范军  
【摘要】: 1.玉米尿卟啉原甲基化酶的功能片段的确定依赖于S-腺苷甲硫氨酸的尿卟啉原甲基化酶(S-adenosyl-L-methionine:uroporphyrinogen methyltransferase,SUMT)是微生物合成西罗血红素、血红素d1、F_(430)因子和维生素B_(12)等卟吩烷类化合物的重要调控酶,植物中SUMT负责西罗血红素生物合成的调控。SUMT催化尿卟啉原Ⅲ在C2和C7位的甲基化,大肠杆菌重组表达的SUMT会在细胞中积累西罗叶绿三酸和过甲基化产物三甲基咕啉,它们在紫外光下产生强烈红色荧光,这种性质可用于检测SUMT在重组系统的体内酶活。 利用不同的限制性内酶切,将编码玉米SUMT的基因切成不同片段,分别插入不同的表达载体中,表达的蛋白分别是玉米SUMT,含有叶绿体导肽的SUMT前体,切除SUMT的N端S-腺苷甲硫氨酸结合模块的截头突变体,和切除SUMT的C端52个氨基酸残基的截尾突变体。其中,SUMT和截尾突变体N端含有组氨酸标签。将所有重组表达载体转化大肠杆菌JM109,结果显示表达融合叶绿体导肽的SUMT前体和截头突变体的重组大肠杆菌菌落没有红色荧光。蛋白检测显示表达的重组蛋白为包涵体,表明叶绿体导肽和SAM结合模块影响酶在大肠杆菌中的折叠。而表达SUMT的N端分别融合表达一段13个氨基酸残基的寡肽、或组氨酸标签,或麦芽糖结合蛋白,重组大肠杆菌菌落显示红色荧光;表达截尾突变体的重组菌落显示红色荧光,表明SUMT的C端52个氨基酸残基对酶活没有显著作用。 分别将表达玉米SUMT和截尾突变体的表达质粒转化大肠杆菌S13009,诱导表达,利用Ni-NTA层析一步纯化了玉米SUMT及截尾突变体,纯度在90%以上。玉米SUMT的亚基分子量在SDS-PAGE上测定约34 kD,凝胶层析测得全酶分子量为52 kD,动态光散射测定全酶分子量约79 kD,表明玉米SUMT是同亚基二聚体。纯化的蛋白结合红色荧光色素。 从纯化的玉米SUMT中分离色素,利用紫外-可见光谱和荧光光谱确定酶结合色素的主要成分是三甲基咕啉,而玉米SUMT氨基酸残基干扰结合色素的荧光激发峰。圆二色性分析表明,去除色素后,玉米SUMT的二级结构有轻微改变,对色素的产生及结合蛋白的可能机制进行了讨论。 2.枯草杆菌尿卟啉原脱羧酶的结构研究 尿卟啉原脱羧酶(Uroporphyrinogen decarboxylase,UROD)是血红素和叶绿素分支合成的第一个酶,控制着生物体内不同卟啉化合物代谢的流向。它催化尿卟啉原Ⅲ或异构体尿卟啉原Ⅰ四次脱羧产生粪卟啉原Ⅲ或Ⅰ,和一般的脱羧酶不同,UROD不含有辅因子。 利用PCR技术从枯草杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA扩增了编码UROD的基因hemE,测序显示编码的UROD有两个氨基酸残基发生改变,分别是Ile155被Thr155取代,Glu198被Lys198取代,扩增产物酶切后插入pET 15b中,表达的枯草杆菌UROD(B.subtilis UROD,bsUROD)N端含有组氨酸标签,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),Ni-NTA一步纯化,蛋白纯度在90%以上。酶的比活为560 U/mg蛋白。纯化的bsUROD亚基分子量在SDS-PAGE上测定约41kD,动态光散射测定全酶分子量约81 kD,表明bsUROD是同亚基二聚体。 利用悬滴法获得bsUROD的晶体,收集到分辨率为2.3(?)的晶体衍射数据,以人UROD的结构作为模型,利用分子置换法解析了bsUROD的晶体结构,晶体空间群为P_1,在bsUROD的模型中,一个晶胞中有四个UROD单体,晶胞参数a=58.612(?),b=80.410(?),c=90.940(?),α=68.681°,β=89.638°,γ=80.817°,bsUROD的最终模型的自由R因子和晶体学R因子分别为19.74%和25.13%,键长和键角的RMSD分别为0.012(?)和1.290°。bsUROD的结构已经投入PDB(PDB code:2INF)。 解析的bsUROD单体结构包括6-88和101-349氨基酸残基,单体只有一个结构域,由(β/α)_8桶折叠组成,酶活中心呈现凹穴结构,利用hUROD和产物粪卟啉Ⅲ的复合物结构,将粪卟啉Ⅲ的结构和bsUROD进行空间叠合,结果显示,bsUROD酶活中心有18个氨基酸残基和粪卟啉Ⅲ有接触,根据对底物的识别和脱羧的功能将它们分为3类。第一类是Asp残基;第二类包含数个极性氨基酸残基;第三类包括数个疏水氨基酸残基。在18个氨基酸残基中,只有Arg29,Arg33,Asp78,Ile79,Phe104,Tyr154,Phe207和His322在30个物种的UROD中是不变的。对它们可能的功能作了讨论。 bsUROD和真核生物UROD结构比较发现有两个loop差别很大,这两个loop的构象变化可能涉及底物的结合和产物的释放。由于UROD和SUMT催化相同的底物,推测SUMT结合尿卟啉原吡咯环NH基团的氨基酸残基和bsUROD一致。 根据bsUROD和催化产物的模拟结构,我们提出了一种新的催化机制,bsUROD中Arg29可能参与脱羧,而Phe144和/或Phe207可能参与捕获二氧化碳分子。 3.参与血红素,西罗血红素和NAD生物合成的酶的纯化及结晶 生物中血红素和西罗血红素是个多功能分子,参与它的生物的酶的结构和功能的研究近年来有很大进展。3-羟邻氨基苯甲酸双加氧酶(3-Hydroxyanthranilic acid 3,4-dioxygenase,HAO)是NAD合成途径中关键调控酶。 我们分别克隆、表达和纯化了枯草杆菌合成血红素的上游和中游的酶,以及西罗血红素分支合成的酶,收集了两个酶的晶体衍射数据,同时分别克隆、表达和纯化了酿酒酵母合成血红素合成下游两个酶和HAO,收集了HAO的晶体衍射数据,由另一同学解析了结构。 根据晶体生长的统计结果,对生物信息技术在蛋白晶体生长的作用,及组氨酸标签在蛋白表达、纯化和晶体生长中的应用、存在问题等作了简要的讨论。


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