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《中国科学技术大学》 2007年
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RIP3诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究

冯珊珊  
【摘要】: 细胞凋亡是一种由基因控制的主动性的细胞死亡过程,它对于维持机体内环境的稳定是至关重要的。RIP3(receptor—interacting protein 3)是RIP丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,它具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和激活NF-κB的作用。此外,RIP3还能通过其C端独特的结构域与RIP结合并募集到TNFR1信号转导复合物中。但到目前为止,关于RIP3的细胞定位以及促凋亡的分子机制仍不清楚。 前人的研究已经表明:RIP3的N端的激酶结构域对于其激酶活性和自磷酸化是必需的,而C端的独特结构域对于其促凋亡活性和激活NF-κB的功能是非常关键的。为了研究其促凋亡的具体机制,我们将RIP3的C端作为研究的重点。我们发现过量表达一个仅包含RIP3的C端从224位到518位氨基酸的缺失突变体,RIP3△N223(tRIP3),就可以在人肝癌细胞系QGY-7703中诱导显著的细胞凋亡。FADD是死亡受体介导的细胞凋亡通路中的关键成员,FADD的显性负性突变体(FADD-dominant negative,FADD-DN)可以在多种细胞系中阻断TNF-α,Fash,或TRAIL激活的死亡受体通路。为了探讨FADD与RIP3在TNFR1信号通路中的相互关系,我们研究发现FADD-DN能明显阻止tRIP3诱导的凋亡;然而RIP3的显性负性突变体(RIP3-dominant negative,RIP3-DN)却不能阻止FADD诱导的凋亡。因此我们推断在TNFR1介导的凋亡信号通路中,tRIP3可能在FADD的上游发挥作用。意外的是:FADD-DN不能阻止RIP3诱导的凋亡。这种差别暗示全长的RIP3与tRIP3可能通过不同的通路诱导凋亡。 考虑到已经有文献报道RIP家族的RIP和RIP4会在死亡受体诱导的凋亡途径中被半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶caspase剪切,我们设想RIP3也会有类似的情况。与预期一致,我们发现在人宫颈癌细胞系HeLa中,RIP3分子会在凋亡刺激下被Caspase-8于天冬氨酸D328位后剪切,这个剪切过程可以被广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK完全抑制,而不能被Caspase-8特异性的抑制剂Z-IETD-FMK所抑制,提示RIP3还可能被其它的分子剪切。全长的RIP3可以同时诱导caspase依赖和非依赖的细胞凋亡,同时还可以激活NF-κB。剪切后产生的两个片段分别包含完整的激酶结构域(N端片断,RIP3-N,aa 1-328)和主要的独特结构域(C端片断,RIP3-C,aa 329-518)。全长RIP3主要在胞质中弥散分布;RIP3-N在整个细胞中都均匀分布;RIP3-C在低表达的情况下保留了RIP3的定位方式,但高表达时可在细胞质中形成点状或丝状的结构。RIP3-N丧失了全长RIP3的一些生理活性,如促凋亡和激活NF-κB;RIP3-C保留了这两种功能但有所改变。RIP3-C只能诱导caspase依赖的细胞凋亡,而且RIP3-C比RIP3诱导NF-κB激活的能力强得多。值得注意的是,外源的RIP3是一个不稳定的蛋白,它的两个剪切片断比全长RIP3的稳定性强,暗示了RIP3的两个结构域对于其不稳定性都有贡献。 我们还观察了RIP3的点突变对其功能的影响。RIP3不被剪切的突变体,RIP3(D328A),表现出与野生型RIP3相似的细胞定位和促凋亡能力。RIP3的赖氨酸K50位对于它的激酶活性和ATP结合都很关键,在RIP家族中十分保守。RIP3(K50A),一个失去激酶活性的点突变体,与去掉激酶结构域的RIP3-C一样,只能诱导caspase依赖的细胞凋亡,这暗示了RIP3的激酶活性对于其诱导的caspase非依赖的凋亡是必需的。本实验室以前的工作阐明了RIP3是一个核质穿梭蛋白,我们发现RIP3(D328A)也可以进行核质穿梭。有趣的是,RIP3(K50A)与RIP3-N都丧失了核质穿梭能力。RIP3-C在胞质弥散分布时可以核质穿梭,然而一旦形成了点状或丝状结构则不能进行核质穿梭。这些结果表明RIP3的核质穿梭与其诱导caspase非依赖的凋亡能力是密切相关的。我们还发现RIP3和RIP3(D328A)在凋亡时均可从胞质进入到细胞核,暗示了RIP3可能在细胞核中诱导caspase非依赖的细胞凋亡。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R730.5

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【参考文献】
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