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EcTrmB和MjNGN的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析

刘琦  
【摘要】: 转录后修饰存在于细胞内所有类型的RNA分子中,是RNA前体加工为成熟RNA分子过程中的一个重要步骤。在细胞内的各种RNA分子中,tRNA分子含有的被转录后修饰过的核苷酸数量最多、种类最丰富。其中发生在46位鸟苷酸的碱基的7号位N原子上的甲基化修饰是很保守的一种修饰,它广泛存在于真细菌、真核生物以及古细菌生物界中。 催化tRNA分子46号位鸟苷酸的7号位N原子甲基化修饰的酶被命名为tRNA(m7G46)甲基转移酶。研究者发现该种酶在真核生物和原核生物中存在着明显的差异。在真核生物中,tRNA(m7G46)甲基转移酶均是由Trm8p和Trm82p两个亚基构成的异源二聚体。其中Trm82p可能起着调节和辅助Trm8p发挥功能的作用。而在原核生物中,此种酶则只含有TrmB一个蛋白质。TrmB/Trm8p蛋白质含有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的结合序列。tRNA(m7G46)甲基转移酶应该属于SAM依赖的甲基转移酶蛋白质超家族。 目前为止,枯草杆菌、肺炎链球菌、酵母和人的tRNA(m7G46)甲基转移酶的三维结构均已得到解析,但是大肠杆菌的tRNA(m7G46)甲基转移酶(后文中简写为EcTrmB)的结构却还一直未被大家所认识。为了深入了解EcTrmB的结构及其工作机制,我们克隆、表达和纯化了全长序列的该种酶,但是经过多次尝试却没有得到蛋白质晶体。此后,我们又设计并克隆、表达和纯化了NH2-端分别缺失18个、25个和32个氨基酸残基的EcTrmB片段。经过不断尝试,我们通过悬滴气相扩散法生长得到了NH2-端缺失32个氨基酸残基的具有良好衍射能力的EcTrmB蛋白质晶体,并成功收集到一套可用于结构解析的X射线衍射数据。EcTrmB晶体属于P21空间群。 在转录的所有步骤中,RNA聚合酶均被各种顺式和反式作用元件高度调控。古细菌的转录过程使用的转录机器是和真核生物类型相似的,但其转录因子却和原核生物的转录因子更为接近。古细菌NusG是一种保守的转录延伸调控因子,它的同源蛋白质无论是在真核生物还是真细菌的转录过程中都发挥着核心作用。 古细菌NusG仅由一个NusG NH2-端结构域NGN和一个KOW结构域组成。这和原核生物NusG非常类似,但与它在真核生物中的同源蛋白质Spt5的结构域组成有着明显区别。Spt5由一个酸性的NH2-端结构域,一个NGN结构域,五至六个KOW结构域和COOH-端的简单重复序列组成。 虽然古细菌NusG的结构域组成和原核生物一致与真核生物有差异,但是,最近的研究证明了古细菌NusG能与RpoE”形成类似于真核生物中的Spt5-Spt4的复合物。综上所述,古细菌NusG既有原核生物NusG的一些特征,又有与真核生物Spt5类似的一些特点。古细菌是生命形式的三大界(domain)之一,它是最接近于原始细胞生物的生命形式。因此,研究古细菌的转录因子并将它和其它物种的同源蛋白质进行比对有助于揭开转录水平上生物进化之间存在的层层关系。 本文主要介绍了古细菌的转录延伸因子NusG,并将它和原核生物的NusG以及真核生物中的Spt5进行了比较。我们从合成的古细菌Methanocaldococcus jannaschii NusG基因上亚克隆了其NGN结构域的编码序列,表达纯化了NGN蛋白质。通过悬滴气相扩散法得到了NGN结构域的晶体,收集了一套X射线衍射数据,并对数据进行了初步的处理和分析。Methanocaldococcus jannaschi NGN晶体属于P3221空间群。


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