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《中国科学技术大学》 2009年
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羟乙基纤维素的接枝改性及其用于蛋白质和DNA分离的研究

彭述华  
【摘要】: 毛细管电泳(CE)是分析带电生物大分子如蛋白质和DNA等最重要的技术之一。它具有分离效率高、分离速度快、样品和试剂消耗量少和易于实现自动化的特性。在毛细管电泳分离蛋白质时,由于毛细管内表面的硅羟基解离(pH3)形成带负电的吸附点,使管壁对带正电荷的碱性蛋白质产生强烈的吸附,导致蛋白质信号峰拖尾、峰形展宽、分离效率与迁移时间的重复性下降,甚至形成不可逆吸附使分离无法进行。解决蛋白质在毛细管壁上吸附的有效办法之一就是对毛细管电泳柱进行涂覆。毛细管涂层的形成大致可分为两类:共价键合和物理吸附。共价键合涂层稳定性较好但制作工艺麻烦;物理吸附方法既简便易行又具有较高稳定性,并且涂层再生能力强,因而备受青睐。 在毛细管电泳分离双链DNA(dsDNA)时,筛分介质需同时具有高筛分能力和自涂覆能力。目前,无胶筛分介质(即非交联的高分子溶液)中,高分子量线形聚丙烯酰胺(LPA)具有筛分能力强、读出长度长等优点。但是,高分子量LPA溶液的粘度很高而且没有自涂覆能力。与之不同的是,聚N, N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)具有极好的自涂覆能力,但筛分能力较弱。如何研制一种兼具高筛分能力和自涂覆能力的高分子溶液介质是DNA高效分析的一个重要课题。在均聚物溶液介质很难同时滿足所有筛分要求时,人们设计合成了一系列共聚物来替代均聚物作为DNA的筛分介质。共聚物不仅可以综合不同单体的各种令人满意的性能,还可以获得一些均聚物所不具备的特殊性能,因此就有可能通过适当调节分子结构和化学组成而得到优良的综合性能。 本论文的目的是对天然高分子羟乙基纤维素(HEC)进行接枝改性,在保持主链HEC高亲水性和筛分能力的同时,根据不同的分离目的,来合成不同功能的接枝聚合物,主要工作如下: 1.羟乙基纤维素接枝改性聚合物的合成与表征 采用硝酸铈铵(CAN)在酸性溶液中发生氧化还原反应合成了羟乙基纤维素接枝聚N, N-二甲基丙烯酰胺(HEC-g-PDMA)和羟乙基纤维素接枝聚甲基丙烯酸N, N-二甲氨基乙酯(HEC-g-PDMAEMA)两种接枝聚合物。该合成方法操作简单,产品后处理简单,实验成本较低,并分别用核磁共振(1H NMR)和红外光谱(FTIR)对产物进行了表征。 2. HEC-g-PDMA在蛋白质分离中的应用 HEC-g-PDMA中主链HEC和侧链PDMA均对毛细管具有涂覆作用,特别是接枝上的PDMA链段,PDMA良好的疏水性能使得聚合物涂层具有很好的稳定性,在起到稳定和抑制电渗流作用的同时,在pH=3~6范围内,实现了对三种碱性蛋白质细胞色素C(Cytochrome C)、溶菌酶(Lysozyme)和核糖核酸酶A(Ribonuclease A)的高效分离,分离的理论塔板数达到105以上。不同接枝密度的HEC-g-PDMA表现出不同的蛋白质分离性能,其中接枝密度最高的HEC-g-PDMA-3具有最高的分离效率,但是分离时间稍长。此外,还利用石英晶体微天平(QCM)定量的表征了HEC-g-PDMA的抗蛋白质吸附性能。 3. HEC-g-PDMA在dsDNA分离中的应用 HEC-g-PDMA在作为聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质的同时,因为HEC和PDMA都具有很好的筛分性能,而接枝上的PDMA还有很好的涂覆性能,起到稳定和抑制电渗流的作用,所以HEC-g-PDMA能应用于dsDNA的分离。在对Φ×174/HaeIII digest样品进行毛细管电泳分离实验中,详细研究了聚合物溶液浓度、聚合物接枝密度和分离电压对dsDNA分离性能的影响。在相同浓度条件下,其中最低接枝密度的HEC-g-PDMA-1对dsDNA有最高的分离度,但是聚合物溶液粘度也最大、分离时间也最长。 4. HEC-g-PDMAEMA在蛋白质分离中的应用 在pH=3~8的条件下,考察了HEC-g-PDMAEMA涂层对蛋白质的分离性能。HEC-g-PDMAEMA中的PDMAEMA链段具有pH值敏感性,在低pH值下发生质子化,因此通过调节缓冲溶液pH值,可以改变PDMAEMA链段所带正电荷数量,同时还可通过调节主链与支链的比例来调节整条聚合物的亲水性。这对毛细管电泳分离碱性蛋白质具有重要意义,体现在:一方面,通过调节PDMAEMA链段所带正电荷数量可以选择适宜分离的电渗流;另一方面,通过调节聚合物主链的亲水性,既能保证涂层与管壁的牢固吸附,又能够抑制与蛋白质疏水基团的相互作用,实现对蛋白质的高效分离。
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q503

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