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《安徽工程大学》 2010年
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磷脂酶A1产生菌的选育

司武阳  
【摘要】: 磷脂酶A1(PLA1)是专一水解天然磷脂Sn-1位酰基的酶,可以得到L-β溶血磷脂。主要从蛇的毒液和动物胰脏中获得,但其总量与工业化生产的要求还相差甚远。目前国外已发现多种微生物均产磷脂酶A1,国内很少有关于筛选产磷脂酶A1菌株的报道,且油脂企业所用酶均从丹麦维诺信公司高价购买。磷脂酶在商业上可用于在炼油过程(油脱胶)磷脂的去除。所以筛选高效产磷脂酶A1菌株并运用于植物油脱胶具有非常现实的意义。 本文以卵磷脂为唯一碳源筛子,从富油土壤中筛选大量菌株,通过添加溴甲酚紫作为显色剂反复挑选出具有较高磷脂酶A1活力的菌株PL-06,初始酶活3.96U/ml,通过一系列生理生化鉴定和16SrDNA鉴定,确定菌株为Serratia profundus strain。通过菌落水解圈法对菌株进行自然选育,并通过紫外及亚硝酸钠复合诱变筛选,摇瓶复筛,建立起一套PLA1菌株的筛选方法。 通过摇瓶培养,对发酵培养基组分进行初步优化,确定了最佳碳源、最佳氮源。结果表明,菌株PL-06最佳氮源为氯化铵,麦芽糖和卵磷脂为最佳复合碳源,浓度分别为2.0%和0.5%,最佳无机盐为FeSO4。发酵48h后酶活较优化前的3.96U/ml提高到6.41U/ml,提高了61.78%。 紫外及亚硝酸钠复合诱变筛选产磷脂酶A1菌株表明:PL-06号菌株为原始菌株,其磷脂酶A1的活力为6.41U/ml。通过紫外与亚硝酸钠复合诱变后,获得了酶活性提高了94.38%的PL-06-F1号菌株,其酶活力为12.46U/ml。另外,实验得出:紫外诱变的最适条件是30W条件下,照射距离30cm,照射1min;浓度0.5mol/L亚硝酸钠诱变的最宜条件是120s作为诱变的剂量。 本文还利用改变发酵时间、发酵温度、pH、转速和接种量来提高菌株产酶。结果表明,最佳发酵周期为48h,最佳发酵温度为35℃,最佳发酵液初始pH为7.0,最佳摇床转速为180rpm,最佳接种量为10%。 为进一步提高筛选的高产菌株PL-06-F1的产酶能力,在PLA1发酵过程中,充分考虑到培养基对菌株的生长产磷脂酶A1的影响。在前期实验结果的基础上,选择对高产菌株PL-06-F1产磷脂酶A1影响较大的3个因素:卵磷脂:麦芽糖,氯化铵,硫酸亚铁进行响应面实验。得出磷脂酶A1产量的数学模型,通过对二次多项回归方程求解,得到3个因子的最优用量:卵磷脂:麦芽糖为4.8:1,氯化铵1.52g/L,硫酸亚铁0.78uM/L,在优化后的条件下培养48h,磷脂酶A1酶活可达到18.44U/ml,比优化前提高了47.52%。
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