胆固醇氧化酶高产菌株的选育及酶学性质初步研究

【摘要】： 胆固醇氧化酶(COD,EC1.1.3.6)是胆固醇代谢过程中最重要的酶之一,它可以催化胆固醇生成胆甾4-烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)和过氧化氢。近年来,随着研究的不断深入,胆固醇氧化酶越来越被人们所重视,更多的应用于临床制药、食品加工、生物农药等方面。 本研究的主要内容包括：胆固醇氧化酶高产菌株的选育；SG03菌株的产酶条件优化；SG03菌株30L发酵工艺的研究；COD的分离纯化和酶学性质的初步研究。 首先从不同来源菌株中筛选初始酶活较高的菌株,通过初筛、复筛等一系列实验,发现蜡状芽孢杆菌产胆固醇氧化酶初始酶活较高,达到0.4108 U/mL。对蜡状芽孢杆菌进行紫外+硫酸二乙酯(DES)的复合诱变,诱变后的菌株SG03酶活达到了1.087 U/mL,是原始出发菌株的2.64倍。遗传稳定性检测实验发现,该菌株在传代时产酶活力比较稳定。 以复合诱变得到的SG03菌株作为COD产生菌,对其发酵培养过程中的培养基组分、培养条件等进行了一系列的优化。单因素实验中确定葡萄糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源,胆固醇含量最佳为0.5%。对培养条件进行优化,发现：pH为7.0时,该菌株发酵液中COD酶活较高,达到1.153 U/mL；培养温度为30℃时,发酵液中COD酶活较高,为1.239 U/mL；摇床的较佳转速为200 r/min。接种量为10%时,胞外COD酶活较大,为1.203 U/mL。菌株培养24 h时,胞外酶活达到最高峰,为1.237 U/mL。响应面优化试验发现,培养基最佳组分为：葡萄糖5.43 g/L,蛋白胨7.11 g/L,胆固醇3.04 g/L。在最适培养基及较佳培养条件下,胆固醇氧化酶的酶活达到了1.463U/mL,比未优化前提高了34.6%。 在此基础上,利用30L全自动发酵罐,对SG03菌株发酵产胆固醇氧化酶的发酵工艺进行了研究。通过对菌体生长过程中生物量的测定发现,菌体的生长在36 h时进入稳定期,最大生物量达到了14.13g/L。SG03菌株胞外胆固醇氧化酶的分泌主要在菌体生长稳定期的后期,发酵40 h时酶活达到最高值,为1.246 U/mL。pH、搅拌速率对产酶的影响试验发现：当pH为7.0时,菌体在发酵培养44 h酶活最高,为1.271 U/mL,随后酶活开始下降；当搅拌速率250 r/min时,发酵42 h时胆固醇氧化酶产量达到了1.317 U/mL。对发酵过程中的残糖浓度的测定结果发现,当发酵时间达到48 h,葡萄糖含量已极低,而菌体的生长此时也已进入衰亡期。 SG03发酵上清液依次经过70%硫酸铵沉淀、CM Sepharose FF离子交换层析以及Sephadex G-75凝胶层析对胆固醇氧化酶进行了纯化,比酶活达到23.467 U/mg,纯化倍数为11.32倍,回收率为21.6%。对纯化的胆固醇氧化酶的酶学性质进行了初步研究,该酶最适pH为7.0,酶活力在5.0～8.0之间较为稳定；最适温度为30℃,在30℃以下酶活力较为稳定。