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高产柚苷酶菌株的选育及发酵过程研究

潘方  
【摘要】: 中国是产柑桔大国,每年柑桔产量超过1000万吨,名列世界第三。柑桔的果实中含有多种营养成份,因此开展柑桔加工和综合利用,很有必要。而果汁在加工过程中,容易产生苦味,分解苦味物质柚皮苷的柚苷酶(脱苦酶)就能较好的解决这些问题。同时,柚皮苷的代谢产物,也是重要的生理活性物质,在医药、食品、日化、石油各领域都发挥着重要作用。本文就选育一株高产柚苷酶菌株并对其进行优化培养做出探索研究。主要研究成果如下: 1以桔皮粉为诱导底物,采用富集培养的方式从堆积腐烂桔皮的泥土中筛选出一株产柚苷酶(Naringinase)的生产菌株WP-108,其摇瓶发酵培养测定其酶活力达910.1U/mL,同时其继代培养稳定性良好。通过对菌株的培养特征,形态特征的观察,初步鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。 2对黑曲霉原生质体进行紫外诱变,研究菌龄、酶系统、渗透压稳定剂、酶解时间、酶解温度等对柚苷酶生产菌株黑曲霉WP-108原生质体形成与再生的影响。结果表明,培养72h的菌丝体,配制蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶的质量浓度1%,按1:1:1体积比混合,在32℃以0.7 mol/LKCl作为渗透压稳定剂酶解3.5小时效果最佳。紫外诱变,进一步筛选出一株正向突变的高产柚苷酶生产菌株WP-108-45,酶活力达1470.1U/ml,是出发菌株的1.6倍。显著提高产柚苷酶能力,酶活遗传性状稳定。 3采用响应面方法对一株能够高产柚苷酶的黑曲霉菌株的发酵产酶培养基进行了优化。通过考察不同碳源、氮源、无机盐对产酶的影响,在此基础上通过Plackett-Burman设计法对发酵培养基主要因子进行筛选,确定主要影响因子为蔗糖、蛋白胨、氯化钾。用最陡爬坡实验逼近以上三因素最优水平,并用中心组合设计以及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。在优化培养条件下,发酵液中酶产量从1470U提高到了1843U,增加了25.4%。 4在节约成本的前提下,对黑曲霉进行固体发酵,采用单因素试验和响应面相结合的方法对产柚苷酶黑曲霉的固态发酵培养基进行了研究。以啤酒糟为主要碳源,添加桔皮粉作为诱导底物,考察不同氮源、无机盐对产酶的影响,对发酵培养基主要因子进行筛选,确定最佳培养条件为:啤酒糟3.202g、桔皮粉0.407 g、NaNO3 0.831 g、(NH4)2SO41.0 g、固液比2:7,加入(NH4)2SO41.0g、K2HPO4 0.5g、NaCl0.3g,此时酶活最高可达到110967.89U/g。


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