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《安徽工程大学》 2010年
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酪蛋白中血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的研究

洪伟  
【摘要】: 酪蛋白是是牛乳中最主要的蛋白质,占牛乳中蛋白质总量的80%。近年来研究表明,酪蛋白中除了富含人体必需氨基酸等营养物质外,还蕴藏着多种功能性生物活性肽。近年来随着高血压发病率日趋严重,人们健康意识的不断增强,源于酪蛋白中降压肽因其安全性高、来源广泛、无副作用的优点在高血压防治的过程中具有十分重要的作用,越来越成为国内外研究的热点。 本课题以酪蛋白为原料,采用蛋白酶水解,确定最佳的水解工艺参数,并获得了较高ACE抑制活性的水解物,对水解液进行了分离纯化。通过以上研究得出以下结论: 首先建立了体外快速测定降血压肽的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的高效液相色谱分析方法。在优化后的条件下,可通过测定由ACE水解马尿酰组氨酰亮氨酸后产生的马尿酸的量得到抑制肽的活性。采用色谱条件为:柱温为25℃,流动相采用甲醇+0.02 mol/L醋酸铵=15+85(V/V),流速1.0ml/min,检测波长228nm。此时,马尿酸浓度与其峰面积呈良好的线性关系(R2为0.9999),马尿酸的平均回收率为99.17%-100.26%。样品处理后经高效液相色谱保留时间定性,峰面积定量。该方法简便快速,具有较好的重复性和精确性,为降血压产品的研制提供了简便可靠的检测手段。 论文在ACE抑制率的测定过程需要大量使用ACE,因此,本文对猪肺中ACE的提取条件进行了优化,得出最佳提取条件:pH为7.6;去杂质硫酸铵饱和度为26%;沉淀硫酸铵饱和度为45%;质液比为1:2.5,在此条件下得到酶液的总酶活力为132.2U,酶比活力为0.362U/mg蛋白,并对粗酶液进行SephadexG-100分离纯化,300g新鲜猪肺最终可制得ACE1027.68 U,比活力为1.085U/mg蛋白,酶活回收率为60.8%。 采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase (Novozymes)水解酪蛋白制备ACE抑制肽,并采取高效液相色谱法测定ACE抑制肽的抑制率,最终确定选择碱性蛋白酶作为水解用酶,制备ACE抑制肽。采用四因素三水平正交实验对碱性蛋白酶水解酪蛋白的条件进行了优化,结果显示在水解温度50℃、E/S为6.0%、pH10.0条件下水解6h的酶解产物对ACE的抑制效果最好,达到95.60%。 采用DA201-C大孔树脂吸附对水解样品进行脱盐处理,用不同浓度乙醇进行梯度洗脱。结果表明脱盐最佳工艺为样品初始浓度为20mg/ml,脱盐流速为0.5 BV/h,解吸剂为75%的乙醇溶液,脱盐处理后的酶解物灰分降至1.34%,抑制率有所提高,脱盐率为92.78%,氮回收率84.22%。 用凝胶层析技术SephadexG-25对脱盐处理后的酪蛋白的碱性蛋白酶水解物进行分离纯化,在如下分离条件下进行凝胶过滤分离取得较好的的分离效果:样品浓度:30mg/ml;上样量:3ml;流速:0.6ml/min;洗脱剂:0.05mol/LHAc-NaAc缓冲液(pH4.0)。制备得到的具有较高活性ACE抑制肽组分D,抑制率为92.3%,其组分蛋白质浓度为0.828mg/ml。再经SephadexG-15进行进一步分离纯化得到更高活性的组分F,抑制活性为96.49%,其组分蛋白质浓度为0.567mg/mL该组分的ACE抑制活性受pH值影响较大,总体上酸性条件下损失大于碱性条件,对热及消化道酶系统都具有较高的稳定性。
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