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《安徽工程大学》 2012年
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黑曲霉糖化酶基因在酵母中克隆和表达

钱鹏  
【摘要】:糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,是一种外切型糖苷酶,含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,分子量在50kD-112kD之间,通常碳水化合物占总量的3.2%-20%。其功能在于从淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶底物专一性较低,它除了能从非还原性末端断裂a-1,4-糖苷键外,也能水解a-1,6-糖苷键和a-1,3-糖苷键。该酶广泛分布于细菌、古细菌和真核生物中。在工业上用于将淀粉转化为葡萄糖,因而广泛地用于制药、酿酒及食品发酵工业中,是最重要的工业酶制剂之一。目前,年产量约70000t,是中国产量最大的酶种。 本文从高产糖化酶的黑曲霉BU11-36的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,经Sac I酶切线性化开后,通过电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6U/mL。测序结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子量大约为80k Da。重组糖化酶酶学特性测定显示:该酶最适反应pH和温度分别为5.0和50℃Cu2+对重组糖化酶的抑制作用明显强于Fe3+、Ca2+、Zn2+。非离子型的表面活性剂(TritionX-100、吐温-20、吐温-80)对糖化酶有提高的作用,而阴离子表面活性剂(SDS)对糖化酶有抑制作用。 利用相同的方法将黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pYES2相连,构建重组载体,电转化酿酒酵母INVScl,经碘熏染法筛选阳性克隆并进行研究。重组酿酒酵母的糖化酶最大酶活为4.3u/mL,重组酿酒酵母糖化酶的最适反应温度为55℃。重组糖化酶的最适反应pH为4.0,淀粉水解力大约为60%,重组酿酒酵母的酒精发酵能力为3.5%。SDS-PAGE电泳显示重组酿酒酵母分泌蛋白的分子量约为70kD。
【学位授予单位】:安徽工程大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q78

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郑敏,张飞雄,刘丽;酵母表达系统表达外源基因的研究进展[J];首都师范大学学报(自然科学版);1999年04期
2 欧阳立明,张惠展,张嗣良,刘志敏;巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2000年02期
3 江正兵,宋慧婷,马立新;短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究[J];生物工程学报;2003年01期
4 刘守安,李多川,俄世瑾,张燕;嗜热毛壳菌纤维素酶(CBHⅡ)cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[J];生物工程学报;2005年06期
5 郭建强;李运敏;岳丽丽;邱阳生;矫庆华;;超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达[J];生物工程学报;2006年02期
6 姚婷婷;王衍敏;顾建龙;王正祥;;携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究[J];生物工程学报;2006年04期
7 赵慧,郑文岭,马文丽;信号肽对外源蛋白分泌效率的影响[J];生命的化学;2003年03期
8 唐香山,张学文;酿酒酵母表达系统[J];生命科学研究;2004年S1期
9 刘增然,李树立,张光一,刘世贵;高效表达淀粉酶的工业酿酒酵母菌株的构建[J];食品与发酵工业;2004年09期
10 文立民,于松涛,李浩,赵大健;糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达[J];食品与发酵工业;1994年04期
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1 王成军;玉米生产区发展燃料乙醇产业研究[D];吉林大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 郭超英;我国新能源产业发展政策研究[D];西南石油大学;2011年
2 宋浩雷;利用敲除技术构建酿酒酵母SFA1/ADH3基因缺失突变株的研究[D];福建师范大学;2007年
3 徐顺清;黑曲霉木聚糖酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究[D];华中农业大学;2009年
4 王永刚;马铃薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因的分子克隆及其在毕赤酵母菌中的表达[D];兰州理工大学;2010年
【共引文献】
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1 许冰斌;谢菲;韩瑞枝;黄钧;周荣清;;角蛋白酶生产菌种选育及脱毛应用的研究[J];皮革科学与工程;2010年04期
2 王红亮;;小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达[J];新乡学院学报(自然科学版);2011年04期
3 易克传;李慧;刘晶晶;;中草药动态连续逆流提取机[J];轻工机械;2009年05期
4 李媛媛;冮洁;邴晓会;;重组酿酒酵母r-PA发酵条件的优化[J];齐齐哈尔大学学报;2006年01期
5 王世伟;李旭业;张伟伟;;优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究[J];齐齐哈尔大学学报;2009年02期
6 杨书林;;我国太阳能产业发展面临的问题及对策分析[J];企业导报;2011年21期
7 李泽友;王勇;张俊清;;益智提取物的制备工艺及质量控制方法研究[J];中国热带医学;2010年04期
8 李晓宇;张横江;柳志强;刘美珍;;奥默柯达酵母植酸酶基因phy1在毕赤酵母中的表达[J];热带作物学报;2011年02期
9 肖建勇;谭宇蕙;李刚;李宝健;;LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达[J];广州中医药大学学报;2012年01期
10 朱丹丹;董燕;周联;华贵煌;;鱼腥草叶片总RNA提取方法的比较与分析[J];广州中医药大学学报;2012年03期
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1 石琳;;关于中国核电产业改革的建议[A];2010’第五届绿色财富(中国)论坛会刊[C];2010年
2 郭丽;王娇娇;肖凯;;植物植酸酶的生化特征和转基因表达植酸酶的研究进展[A];作物逆境生理研究进展——中国作物生理第十次学术研讨会文集[C];2007年
3 李丹;;可再生能源法律问题研究[A];资源节约型、环境友好型社会建设与环境资源法的热点问题研究——2006年全国环境资源法学研讨会论文集(二)[C];2006年
4 郭迪;潘力;杨汝德;;耐盐乳酸菌的筛选和鉴定[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
5 罗威;罗立新;潘力;杨汝德;王亚琴;;双歧杆菌发酵荔枝汁开发活菌保健饮品的研究[A];第三届“益生菌、益生元与健康研讨会”论文集[C];2004年
6 王云;;我国可再生能源政策的发展历程及对策选择[A];可再生能源开发利用研讨会论文集[C];2008年
7 张威;亚国伟;陈玉;陈奎生;;雷帕霉素及mTOR siRNA对食管癌EC9706细胞mTOR基因表达影响的研究[A];2010’全国肿瘤分子标志及应用学术研讨会暨第五届中国中青年肿瘤专家论坛论文汇编[C];2010年
8 肖美丽;宋小亚;;大型真菌功能基因克隆研究进展[A];首届全国食用菌中青年专家学术交流会论文集[C];2006年
9 蒋宗勇;周桂莲;李得忠;蒋守群;陈芳;林映才;郑春田;;不同非植酸磷和基因工程酵母菌植酸酶水平对43-63日龄黄羽肉鸡生长和胫骨发育的影响[A];全球肉鸡产业论坛暨第二届中国白羽肉鸡产业发展大会会刊[C];2010年
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1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 张曈;海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用[D];中国海洋大学;2010年
3 王岩;养心汤含药血清对H_2O_2诱导内皮损伤模型差异基因及ST3GAL2mRNA表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2010年
4 李彧娜;微孢根霉华根霉变种CICIM F0088生淀粉酶系的研究[D];江南大学;2010年
5 米东;PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究[D];南开大学;2010年
6 孙万里;稻草秸秆的预处理及生产乙醇的研究[D];江南大学;2010年
7 尤卓雅;能源替代、安全约束和经济增长[D];浙江大学;2011年
8 王秀娟;嗜热真菌纤维二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和内切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造[D];山东农业大学;2011年
9 徐立新;MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D];吉林大学;2011年
10 韦小敏;斜卧青霉胞外蛋白质组学分析与纤维素酶合成调控机制研究[D];山东大学;2011年
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1 于宾宾;表达猪β-防御素-2成熟肽重组酵母工程菌的构建[D];华中农业大学;2010年
2 姚秋林;水稻根特异表达启动子的克隆及功能分析[D];华中农业大学;2010年
3 徐珏;毕赤酵母表达的ACE-C结构域高效发酵及纯化工艺的研究[D];浙江理工大学;2010年
4 王志强;内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达[D];郑州大学;2010年
5 侯萌萌;烟草茄尼醇合成途径中dxps基因的克隆与表达[D];郑州大学;2010年
6 郭晓红;嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究[D];山东农业大学;2010年
7 康雪燕;猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析[D];山东农业大学;2010年
8 张艳云;番茄E8基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达分析[D];甘肃农业大学;2010年
9 严伟杰;纯生啤酒有害菌检测培养基优化和快速检测方法研究[D];河南工业大学;2010年
10 潘涛;一株酸性α-淀粉酶产生菌的筛选、发酵条件及基因克隆研究[D];河南工业大学;2010年
【二级参考文献】
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1 胡志远,浦耿强,王成焘;木薯乙醇汽油车生命周期排放评价[J];汽车工程;2004年01期
2 唐联坤;淀粉的基本特性及其应用[J];青海科技;1996年02期
3 张继福;马铃薯酒精发酵的研究[J];青海科技;1999年02期
4 边疆;美国能源乙醇的历史、现状和发展趋势[J];全球科技经济瞭望;2001年03期
5 李文凯;美国促进代用燃料汽车发展[J];全球科技经济瞭望;2003年02期
6 洪峡;;美国可再生能源政策研究[J];全球科技经济瞭望;2008年02期
7 吴建勋;乙醇汽油推广困难的营销分析[J];企业技术开发;2003年13期
8 王文泉,李开绵;借燃料乙醇工业发展东风开拓我国木薯产业新局面[J];热带农业科学;2003年03期
9 王世宽,潘明;桑叶/马铃薯发酵饮料的研制[J];四川轻化工学院学报;2001年03期
10 秦玉静,刘巍峰,高东,鲍晓明,郑华军;含α-乙酰乳酸脱羧酶基因重组酿酒酵母的啤酒发酵[J];山东大学学报(自然科学版);2000年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 江正强;海栖热袍菌xynB基因的克隆和表达、重组木聚糖酶的提纯及其酶学性质[D];中国农业大学;2001年
2 谢治国;新中国能源政策研究[D];中国科学技术大学;2006年
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1 王晓红;产低温淀粉酶菌株的筛选及其酶学性质的研究[D];新疆农业大学;2006年
2 柯建飞;可再生能源经济激励机制研究[D];福州大学;2006年
3 李越;中国风电特许权项目综合分析及改进建议研究[D];华北电力大学(北京);2007年
4 刘晶;中国石油安全研究[D];华中师范大学;2007年
5 汪成;中国能源结构调整中核电发展及技术经济分析[D];华中科技大学;2006年
6 张丹玲;中国可再生能源发展的政策激励研究[D];西北大学;2008年
7 董旭光;山东省太阳能资源评估[D];兰州大学;2009年
8 蔡璐;德国太阳能发电产业的发展经验及对我国的启示[D];吉林大学;2010年
9 王博;基于市场机制的可再生能源发展政策的均衡分析[D];西北大学;2010年
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1 张冬梅,潘卫庆,陆德如;恶性疟裂殖子表面蛋白1合成基因在毕赤酵母中的表达[J];生物工程学报;2000年06期
2 冮宏映,李洪钊;一种获取巴斯德毕赤酵母高拷贝重组子的新方法[J];生物技术;2003年02期
3 杨梦华,李颖,关国华,江正强;极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达[J];微生物学报;2005年02期
4 李洪淼;王红宁;许钦坤;;重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶[J];中国生物工程杂志;2005年S1期
5 杨莉莉;贺巾超;马杰;范伟全;王建秋;魏传宇;颜浩为;颜炜群;;PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI[J];吉林大学学报(医学版);2005年06期
6 董杜鹃;扈进冬;张新昌;李子劲;王金星;赵小凡;;棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达[J];中国生物工程杂志;2006年02期
7 乔宇;陈小兵;丁宏标;岳明;;甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J];中国生物工程杂志;2006年07期
8 王隆飞;方园园;陈功;博涛;侯健华;杨少辉;李桂兰;李欣;李明刚;;产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建[J];南开大学学报(自然科学版);2006年05期
9 丁镌;宋跃芬;袁野;刘娣;;毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策[J];畜牧与兽医;2007年02期
10 徐煌;韩冬;王芳;钟辉;周秋丽;颜炜群;;人热休克蛋白110在毕赤酵母中的表达及鉴定[J];中国老年学杂志;2007年08期
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1 仝光杰;楼觉人;;HPV52 L1蛋白在毕赤酵母中的优化表达[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
2 金光泽;段作营;张莲芬;金坚;李华钟;;重组融合人血清白蛋白/人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3 崔栩;曹云鹤;;两种β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达研究[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
4 周宇飞;袁汉英;吕红;;人超氧化物歧化酶-胸腺素α1在毕赤酵母中的表达、纯化与活性检测[A];2012年中国青年遗传学家论坛会议文集[C];2012年
5 傅小强;吴少庭;黄汉菊;刘洪波;;结核杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中表达及其鉴定[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
6 王宏伟;金宁一;;抗HIV—1gp120单链抗体基因的克隆及其在毕赤酵母系统中的表达[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
7 汤丹;刘松财;史勇;李莉;张英;郝林琳;;甜味蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
8 苏曼曼;许天敏;王毅;宿晓云;颜炜群;;重组人载脂蛋白E3在毕赤酵母中的表达与鉴定[A];吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C];2008年
9 廖娟;王红宁;田浪;阳泰;张毅;;禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
10 刘高科;何莉;杨永涛;汪正清;;人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
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1 记者  范建;毕赤酵母能“吃掉”多种有机磷农药[N];科技日报;2006年
2 ;基因科学的耕耘者[N];上海科技报;2008年
3 董丹 刘昱辉 吴元华;基因工程生产降钙素研究方兴未艾[N];中国医药报;2007年
4 丛秀明;有机磷农药降解酶制剂制成[N];中国化工报;2006年
5 戴炳仁;我国发明果蔬迅速脱毒生物技术[N];中国国门时报;2006年
6 刘晴;有机磷农药降解酶制剂[N];农村医药报(汉);2006年
7 李菲;EPO“黄金时代”来临[N];医药经济报;2006年
8 记者 陈卫东;我破解基因工程产业化难题[N];科技日报;2007年
9 周铮;我国研制成功"有机磷农药降解酶制剂"[N];农民日报;2006年
10 记者 朱永坤;有机磷农药降解酶研制步入工业化[N];农资导报;2007年
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1 卢忠民;IL-18 RGD模体的构建及生物活性的研究[D];大连医科大学;2005年
2 刘堰;重组人白介素-2(IL—2)突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化[D];重庆大学;2002年
3 马杰;人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究[D];吉林大学;2005年
4 万榕;蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)抗黑色素瘤细胞侵袭与转移的作用[D];福建医科大学;2005年
5 杨莉莉;重组牛胰蛋白酶抑制剂的研究[D];吉林大学;2006年
6 王海燕;荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2006年
7 陈伟莉;重组人TRAIL的制备和抗肿瘤作用的研究[D];吉林大学;2007年
8 吴丽娟;重组人A20的分子设计及酵母表达研究[D];重庆医科大学;2004年
9 樊建勇;人源性抗角蛋白抗体的高效表达及其作用研究[D];第四军医大学;2004年
10 张慧(Farzana Rashid);Hepcidin 20基因克隆及在毕赤酵母中的表达[D];北京化工大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 钱鹏;黑曲霉糖化酶基因在酵母中克隆和表达[D];安徽工程大学;2012年
2 牛超;重组人弹力素大规模发酵工艺的优化[D];吉林大学;2010年
3 翟立公;Spinigerin a抗菌肽基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];吉林农业大学;2011年
4 李洋;重组人FGF-2的制备及活性研究[D];吉林大学;2010年
5 陈丽;多拷贝毕赤酵母重组菌表达PIP生理特性和动力学研究[D];华东理工大学;2011年
6 王少然;二硫键对菌丝霉素抗菌活性的影响及菌丝霉素聚体在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2011年
7 朱维宁;小麦类脱水素基因wzy2的克隆及在毕赤酵母中的功能分析[D];西北农林科技大学;2010年
8 李昆鹏;重组猪生长素基因工程菌培养基优化及高密度液体发酵研究[D];兰州理工大学;2011年
9 吴殿君;重组奶牛神经肽Y基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性分析[D];吉林大学;2011年
10 刘琨;酵母Bir1p同源物Survivin对毕赤酵母的分子重组与生长影响[D];华东理工大学;2010年
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