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《安徽工程大学》 2019年
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根瘤菌发酵产胞外多糖和富硒多糖及其活性分析

王路瑶  
【摘要】:微生物多糖由于具有独特的理化性质和生物活性而得到广泛研究和应用。微生物多糖是一种生物大分子,其种类繁多,结构复杂,具有显著的微生物多样性和差异性,而且绝大多数微生物多糖资源及其理化特性和应用尚未得到开发和深入研究。因此,筛选和分离新型微生物并研究其所产多糖的组分、结构和生物活性,对开发新型微生物多糖资源,获得具有潜在应用价值的微生物多糖及其衍生生物活性物质,具有较大的研究意义。本文从自然界中筛选获得一株产胞外多糖(Extracellular Polysaccharide,EPS)的菌株并鉴定为根瘤菌(Rhizobium sp.)。在对根瘤菌产EPS发酵条件优化的同时,对胞外粗多糖进行了分离纯化及其组分分析。此外,研究中利用根瘤菌发酵法实现了胞外硒多糖(Selenium Extracellular Polysaccharide,SEPS)的制备并对SEPS的结构、形态及抗肿瘤活性进行了研究。主要研究结果如下:(1)从蒲公英根部筛选分离出菌株,结合形态学观察、发酵产物特性和16S rDNA分子序列分析方法将该菌株鉴定为根瘤菌属(Rhizobium sp.)。单因素摇瓶发酵实验表明葡萄糖、酵母粉、马铃薯浸出汁和豆芽汁对根瘤菌发酵产EPS具有显著影响。上述4个单因素的响应面试验设计,研究结果显示,产EPS的最佳营养因素组合为:葡萄糖浓度为35.59g/L、酵母粉浓度为25.58 g/L、马铃薯浸出汁浓度为30.56%和豆芽汁浓度为20.29%。在该组合条件下,根瘤菌EPS产量提高了141%,达到15.46g/L。基于摇瓶发酵优化条件,利用10 L发酵罐扩大培养,EPS产量得到进一步提高,最高达到28.2 g/L。(2)依次对发酵液中的胞外粗多糖进行醇沉、脱蛋白及柱层析处理和分离之后,纯化得到EPS 1-1、EPS 2-1、EPS 3-1、EPS 4-1和EPS 5-1 5种单一多糖组分,并分别利用高效凝胶过滤色谱、离子色谱和红外光谱对各多糖组分进行分析。结果显示:5种单一EPS的分子量分别为1.905×107、1.053×107、6.370×106、7.187×106和6.155×106 Da。其中,EPS 1-1、EPS 2-1和EPS 5-1均主要由Gal、Glu和Man组成,其摩尔比分别为1:4.67:2.35、1:4.69:4.33和1:7.72:1.69。此外,三种组分中还含有少量的Fuc、Rha和Ara等。EPS 3-1由4种单糖组成,其主要单糖摩尔比为Gal、Glu和Man=1:3.42:4.77,还有少量的Rha;EPS 4-1由3种单糖组成,摩尔比为Gal、Glu和Man=1:5.54:1.9。红外光谱测定结果表明,5个单一组分均是由β-型糖苷键连接形成的多聚吡喃糖,且EPS 1-1和EPS 3-1亦可能含有半乳吡喃糖。(3)利用摇瓶发酵产根瘤菌SEPS并对Na2Se03的添加时间及浓度进行了优化,结果表明在发酵至第6 h时添加浓度为5 mg/mL Na2Se03溶液,所得SEPS产量最高为4.3 g/L,其硒含量为792.84μg/g。在10 L发酵罐中进一步分别对Na2Se03和流加培养基的浓度进行了控制和优化,获得SEPS的最高产量为26.8 g/L,比未优化前提高了523.26%,其硒含量为1205.15 μg/g,是摇瓶发酵产量的1.52倍。红外光谱分析对显示,SEPS新增两处吸收峰,一处在1542 cm-1处左右为多糖链与Se032-结合形成的O-O键;另一处在1249 cm-1处左右可能是Se=O键形成的新吸收峰;扫描电镜结果也显示了EPS和SEPS两者形态存在明显差异,EPS的形态为片状或长条状,而SEPS则呈现为圆柱形或棒状。结果表明,硒通过O-O键或Se=O键与成功地EPS结合,从而改变了EPS的形态。(4)通过体外细胞实验,比较了EPS和SEPS两种多糖对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活力的影响。实验结果表明,在一定浓度范围(0~2000 μg/mL)内,EPS和SEPS对小鼠4T1细胞均具有细胞毒性,而在相同多糖浓度条件下,SEPS对肿瘤抑制率均高于EPS。当多糖浓度为2000 μg/mL时,EPS溶液孵育的细胞存活率为52.94%。而此时使用SEPS溶液孵育细胞其细胞存活率仅为31.16%。
【学位授予单位】:安徽工程大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ920.6;TQ281

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