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《安徽工程大学》 2019年
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枯草芽孢杆菌发酵产聚谷氨酸及其分离纯化的研究

刘宁  
【摘要】:γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种由微生物发酵生产得到的水溶性高聚物,具有优良的吸水,保水性、生物相容性和可降解性。作为一种新型高分子材料,,γ-PGA及其衍生物在食品、药品、环保等方面具有广阔的开发与应用前景。然而,目前居高不下的市售价格制约和阻碍了γ-PGA及其产品的深入开发与应用。导致这样状况的主要原因是微生物发酵制备γ-PGA的产率较低及其分离成本过高。为此,本文通过对比研究固/液态不同发酵方式,系统揭示固/液态发酵方式对γ-PGA生产的影响。在此基础上,通过对发酵条件和分离、纯化工艺的优化改进,提升γ-PGA的生产与分离效率,降低y-PGA的生产成本,推动γ-PGA及其产品的开发与应用。具体结果如下:(1)液态发酵研究:独立因素研究显示蔗糖和胰蛋白胨分别为最佳碳、氮源,底物L-谷氨酸对y-PGA的合成影响显著。进一步应用响应面设计优化,获最佳培养基组成(蔗糖28.87 g/L、胰蛋白胨17.56 g/L和L-谷氨酸为15.26 g/L);对发酵条件进行优化,得最适发酵条件为:接种量7.5%,装液量20%,pH 7,发酵温度37℃。在发酵36 h时γ-PGA的产量最大,可达17.42 g/L,是优化前产量的4.98倍。(2)固态发酵研究:主要研究固态基质类型、营养基质破碎程度、固态基质/营养基质、接种量和相关发酵条件等因素对γ-PGA生产的独立效应。结果发现珍珠岩为最佳固体基质,碾碎(八分之一)的大豆与珍珠岩最佳混匀比例为1:1,每100 g固态基质初始加水量为6 mL,在初始pH值为7培养基中,接种量8%,37℃发酵36h后,γ-PGA最大产量为79.12 g/Kg,是优化前产量的1.86倍。(3)NK对γ-PGA生产影响的研究:在分析纳豆激酶(NK)与y-PGA的生产进程曲线时发现,γ-PGA的生产高峰期迟于NK;进一步对比分析液态发酵和固态发酵生产的γ-PGA的分子量情况,结果显示液体发酵生产的γ-PGA分子量比固态发酵的要大,且分布相对集中。因此,初步推断NK可能影响γ-PGA的生产。基于液态发酵方式,通过添加外源NK,探究NK对y-PGA生产的影响。结果表明NK可能通过底物竞争和降解γ-PGA的方式抑制γ-PGA的生产。(4)y-PGA分离、纯化的研究:利用乙醇提取获得y-PGA粗品,再经丙酮、透析和苯酚处理,优化γ-PGA的分离、纯化工艺。结果表明,加入3倍体积的丙酮能够有效提高y-PGA提取率与纯度;透析处理能够去除小分子蛋白与杂质;苯酚处理后进一步提高y-PGA纯度。利用茚三酮比色法检测,纯化后的γ-PGA纯度较高,达到89.12%。纸层析检测结果表明纯化后的γ-PGA主要由单一的谷氨酸组成,不含有其他游离氨基酸。SDS-PAGE凝胶电泳显示,γ-PGA分子量在690-700 kD之间,聚合度较为集中。论文研究结果为微生物发酵生产γ-PGA及其分离纯化的研究提供参考依据,一定程度上降低了γ-PGA的生产成本,推动了γ-PGA的应用。
【学位授予单位】:安徽工程大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ920.6;TQ317

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