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《安徽工程大学》 2019年
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纳豆芽胞杆菌中MenA的异源过表达

丁秀敏  
【摘要】:维生素K2(VK2,MK-n)又叫甲萘醌,是人体新陈代谢中不可缺少的脂溶性维生素,具有多种重要的生理功能。纳豆芽胞杆菌作为生产VK2的主要菌种,其VK2产量较高,是美国FDA公认的益生菌。有研究表明,在大肠杆菌中将VK2合成关键酶1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯转移酶(EcMenA)进行过表达,可以显著提高VK2的产量。而纳豆芽胞杆菌中1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯转移酶(BsnMenA)在天然生物体中丰度较低,目前仍较少被研究报道,因此对于BsnMenA的晶体结构以及具体催化过程还不清楚。本课题对BsnMenA分别进行了生物信息学预测分析,亚细胞定位实验以及在大肠杆菌中克隆与表达的研究,这为后期开展BsnMenA的深入研究奠定理论基础。主要研究内容和结果如下:(1)通过生物信息学软件对BsnMenA的系统进化关系、基本性质、跨膜结构、亲疏水性、结构域的预测与motifs搜索、空间结构等进行预测分析。系统进化树显示,芽胞杆菌属中的MenA高度相似,亲缘关系较近,但与大肠杆菌等其它科中的MenA亲缘关系较远。从理化性质及亚细胞定位预测,初步确定BsnMenA属于膜结合型蛋白质。结构域与motifs搜索预测显示,BsnMenA的34-278氨基酸组成典型的UbiA结构功能域,其中74-84和204-212分别存在NxxxDxxxxxD和NNxxDxxxD的Asp-rich motifs结构。同源序列比对发现BsnMenA中第74、204、205天冬酰胺和208、84、78、212天冬氨酸是其关键氨基酸位点。通过折叠识别建模法,模拟出BsnMenA的三维空间结构,是由9个跨膜螺旋组成的一个活性中心腔,这与匹配度最高的嗜热系古生细菌中的4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶(ApUbiA)极其相似,由于BsnMenA与ApUbiA空间结构高度相似,因此推导出BsnMenA的催化功能有关的保守结构域位点及其催化机制。(2)为了进一步探究BsnMenA在大肠杆菌中的亚细胞定位情况,本章节通过重叠 PCR扩增法,成功构建了重组菌BL21/pET28a-menA-egfp(MEP28)和BL21/pET28a-egfp-menA(EMP28),随后对这两株重组菌以及阳性对照BL21/pET28a-egfp(EP28)和阴性对照BL21/pET28a(P28),以相同的培养条件下进行发酵和诱导表达,诱导条件为IPTG浓度0.2 mM,诱导温度28℃,摇瓶转速150 rpm,并采取实时取样的方式。将诱导发酵结束后的样品用激光共聚焦荧光显微镜观察,显示结果为:当诱导时间为20 min时,重组菌MEP28和EMP28的细胞膜上均有明显可见荧光,而阳性对照EP28整个细胞布满荧光,阴性对照P28则未见明显的荧光。该实验不仅再次验证BsnMenA是膜蛋白,而且充分说明膜蛋白menA以及egfp在大肠杆菌中可以表达并且正确折叠。(3)为了深入研究BsnMenA在大肠杆菌中的克隆与过表达情况。首先,经PCR扩增得到的menA分别与pET22b(+)和pET28a(+)连接,并转入大肠杆菌JM109中,得到重组菌JM109/pET28a-menA和JM109/pET22b-menA,将发酵后提取重组质粒转入BL21(DE3)中,得到重组菌BL21/pET28a-menA(MP28)和BL21/pET22b-menA(MP22)。其次,以LB培养基为发酵培养基时,将MP22、MP28以及阴性对照BL21/pET22b(P22)和BL21/pET28a(P28)在IPTG终浓度分别为0.2 mM和0.8 mM条件下,进行低温诱导表达,通过制备BsnMenA的粗提样品并进行SDS-PAGE检测,均无明显可见蛋白条带。再次,以含有0.5%葡萄糖的LB培养基为发酵培养基时,将MP22、MP28、P22和P28在0.5 mM的IPTG中,进行低温诱导表达,SDS-PAGE检测发现MP22在38 KD处有明显可见蛋白条带,而在MP28的蛋白电泳图中却未见明显条带。通过本实验,发现MP22在0.5%葡萄糖的LB培养基中具有过表达BsnMenA的潜力,并且初步建立了适合BsnMenA异源过表达的方法。为后期对MP22进行系统性发酵条件优化、BsnMenA纯品的获得以及酶学性质的研究奠定一定的理论基础。
【学位授予单位】:安徽工程大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78

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