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《安徽农业大学》 2010年
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几株蛹草拟青霉原生质体制备及染色体核型研究

汪小艳  
【摘要】: 本文对蛹虫草无性型蛹草拟青霉的产孢培养基、酶解条件、原生质体制备等方面进行了研究,同时以温汉逊氏酵母Hansenula wingei YB-4662-VIA和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe 972h-染色体DNA作为标准指示样品,利用等强度均一电场(Contour-clamped Homogeneous Electric Field,CHEF)凝胶电泳技术比较了蛹草拟青霉菌株的电泳核型。 培养基对菌株产孢量的影响实验中发现,除了菌株RCEF0848外基本上都以SMAY培养基最好,产孢量最大,菌株RCEF0848的产孢量以在察氏培养基上培养后的产孢量最大。 酶解过程中存在着各种影响因素,包括酶的选择、酶反应温度、酶反应时间等。总体上混合酶液的效果好于单一酶类的作用效果。用相同浓度的蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶混合配成的酶解液酶解效果最佳;酶反应温度在30~35oC温度范围内,原生质体的产量相差不多,高于或低于这个范围时原生质体产量都会下降,但通过后期实验结果同时考虑到原生质体的质量,选择31oC为最适反应温度,在120r/min的条件下震荡处理2.48h即可获得大量的原生质体,为后续实验打下好的基础。 原生质体产生过程中观察到一系列现象:原生质体在释放过程中体积变化较大,大小各不一致,前期产生的原生质体直径较小,后期产生的原生质体直径较大。原生质体在释放过程中主要有顶端、侧位、及原位三种释放方式,释放后期基本以原位释放为主。另外,还发现一种现象,即当两个原生质体靠的很近时,两者可以发生自然融合现象。 经过对电泳条件的多次筛选,认为最理想的电泳条件是分两个阶段进行,以利于大小条带的分离。两个阶段分别从电泳时间、电泳液的温度、电泳缓冲液的种类、琼脂糖浓度、电压、脉冲转换的时间、转换的角度等方面考虑。第一阶段:时间为48h,温度14℃,电泳缓冲液1×TAE,琼脂糖浓度0.8%,电压2v/cm,脉冲时间20~30min,转换角度106°;第二阶段:16h,14℃,1×TAE,0.8%,3v/cm,500s,106°。 以标准指示(marker)样品估算蛹草拟青霉的染色体大小和核型大小,结果为:蛹草拟青霉RCEF0096最小的染色体估算其大小为2.04Mb,最大的染色体估算大小为5.76Mb,整个染色体条带在31.0Mb以上;菌株RCEF4544染色体DNA最大及最小分别为5.69、2.04Mb,整个染色体条带在28.2Mb以上;菌株RCEF0848染色体DNA大小在2.0~5.7Mb,整个染色体条带在28.0Mb以上。故推算蛹草拟青霉基因组大小在28.0~31.0Mb。 核型分析表明蛹草拟青霉种内各菌株间核型存在一定的差异,呈现明显的多态性,与其生存环境、寄主的多样性、以及培养过程中易退化等等因素有着微妙的关联。但各个菌株间最大染色体DNA大小和最小染色体DNA大小的估算值接近,同时条带的个数也是相同的。说明这种差异从某个角度来说是不那么显著的,这也与文献中指出的真菌电泳核型差异是种间大于种内、属间大于种间等相符。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S567.35

【引证文献】
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【同被引文献】
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4 庞波 本报记者 李秀华;东北虫草有了“北安制造”[N];黑河日报;2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘作易;虫草属及其无性型关系研究[D];华中农业大学;1999年
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