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Ghrelin对大鼠下丘脑—垂体—性腺的影响及其机理研究

王琳  
【摘要】: 目的:探讨Ghrelin、GHS-R1a在下丘脑-垂体-性腺上的定位以及Ghrelin mRNA在其上的表达。分析Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在不同发情周期大鼠下丘脑-垂体-卵巢上的表达丰度。研究外源性Ghrelin对促性腺激素、性腺激素的分泌及其基因表达的影响。从而揭示Ghrelin对大鼠生殖轴的作用途径和机理。 方法:(1)分离成年SD大鼠的下丘脑、垂体、卵巢和睾丸,经4%多聚甲醛固定,制成石蜡切片,采用免疫组织化学方法观察Ghrelin及其受体GHS-R1a在上述组织中的定位。(2)使用地高辛标记的Ghrelin寡核苷酸探针,采用原位杂交方法观察Ghrelin mRNA在下丘脑、垂体、卵巢和睾丸中的表达。(3)实时荧光定量PCR法分析Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在不同发情周期大鼠下丘脑、垂体、卵巢上的表达丰度。(4)采用1%的戊巴比妥钠1mL对大鼠进行腹腔注射,麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪,采用不同剂量的Ghrelin(0.3nmol、1nmol、3nmol和生理盐水对照组)对雄性大鼠和不同发情周期大鼠进行侧脑室注射,15 min后断头采血,酶联免疫分析法测血清促黄体素、促卵泡素浓度,放射免疫分析法测血清睾酮、雌激素和孕酮的浓度。(5)分离试验四大鼠的下丘脑、垂体、卵巢和睾丸,实时荧光定量PCR法分析FSH、LH、GnRH、AR、ERβ和PRA+B mRNA表达丰度。(6)成年雄性大鼠和25 d的雌性大鼠断头处死,收集睾丸间质细胞、黄体细胞和颗粒细胞于CO2培养箱内培养6 h,收集培养液和细胞,采用酶联免疫、放射免疫分析法测培养液中睾酮、雌激素和孕酮的浓度,实时荧光定量PCR法分析AR、ERβ和PRA+BmRNA的表达丰度。 结果:(1)Ghrelin与其受体GHS-R1a在下丘脑弓状核、腹内侧核、正中隆起,腺垂体,睾丸间质细胞、精母细胞、睾丸支持细胞,卵母细胞等中均有分布。(2)在下丘脑、垂体、睾丸中,Ghrelin mRNA显示和Ghrelin一致的分布方式,在卵巢中,显示出差异性表达。(3)Ghrelin和GHS-R1a在不同发情周期大鼠的下丘脑、垂体中均有表达,且其表达丰度随发情周期的变化而变化。在卵巢中仅发现Ghrelin mRNA表达,在整个发情周期均未检测到GHS-R1a mRNA表达。(4)侧脑室注射Ghrelin能抑制促性腺激素、性腺激素的分泌,其作用效果与所处发情周期、注射的剂量、性别有关。(5)侧脑室注射Ghrelin显著抑制GnRH mRNA、FSH mRNA、LH mRNA、ERβmRNA、PRA+B mRNA、AR mRNA的表达,其抑制效果与注射剂量与所处发情周期有关。(6)在体外,Ghrelin显著抑制孕酮、雌激素的分泌和ERβmRNA、PRA+B mRNA的表达。但对睾酮的分泌、AR mRNA的表达不起作用。 结论:Ghrelin、GHS-R1a和Ghrelin mRNA在大鼠下丘脑、垂体和性腺上均有分布,Ghrelin通过与其受体相互作用,在中枢和外周水平上抑制大鼠促性腺激素和性腺激素的分泌和促性腺激素释放激素、促性腺激素和性腺激素受体基因的表达,且这种抑制作用受发情周期、剂量、性别的限制。


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